[发明专利]HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用有效
| 申请号： | 202110155151.4 | 申请日： | 2021-02-04 |
| 公开（公告）号： | CN112852745B | 公开（公告）日： | 2023-05-23 |
| 发明（设计）人： | 侯石桐;孙跃峰;王相伟;殷相平;毛箬青;赵帅阳 | 申请（专利权）人： | 中国农业科学院兰州兽医研究所 |
| 主分类号： | C12N5/10 | 分类号： | C12N5/10;C12N15/113;C12N15/85;C12Q1/70;C12Q1/6851;G01N33/569;G01N21/31;C12R1/91 |
| 代理公司： | 北京兴智翔达知识产权代理有限公司 11768 | 代理人： | 郭卫芹 |
| 地址： | 730046 甘肃*** | 国省代码： | 甘肃;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | hdac3 基因 bhk 21 细胞系 及其 构建 方法 应用 | ||
1.HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：根据NCBI中金仓鼠的HDAC3基因序列，利用CRISPOR软件在HDAC3的第1个外显子区域设计gRNA序列：GGGGTCGTAGAAATACGCCA；设计好的gRNA，合成、退火并连接至PX459质粒；测序正确的CRISPR质粒中抽备用；根据Invitrogen Lipofectamine 2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染BHK-21细胞系，转染48h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选5-7天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆，转移至24孔板，扩大培养；收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定。
2.根据权利要求1所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：细胞培养在5％CO2培养箱中，温度为37℃，DMEM培养基中添加有10％胎牛血清和1％抗生素penicilin-streptomycin。
3.根据权利要求1所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：DNA水平鉴定时用以下引物扩增：GT-FPCTAGGAAGGATGTCGCGGTC，GT-RPATGTCCAGCCCACCTATCCT，扩增产物进行Sanger测序；蛋白水平鉴定时用HDAC3的抗体，利用Western blot检测HDAC3的蛋白表达水平。
4.根据权利要求1所述的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：得到HDAC3敲除细胞HDAC3-KO-1、HDAC3 KO-2，HDAC3-KO-1在Cas9距离PAM基序第3和第4个碱基之间切割有4个碱基的缺失，HDAC3-KO-2在该位置有1个碱基的插入；用Western blot检测内源HDAC3的蛋白表达水平，HDAC3-KO-1、HDAC3KO-2细胞系不能检测到HDAC3的蛋白表达。
5.权利要求1-4中任一项所述方法构建的HDAC3基因敲除的BHK-21细胞系。
6.基于权利要求1-4中任一项方法得到的HDAC3基因敲除细胞系在制备口蹄疫疫苗中的应用。
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