[发明专利]HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系及其构建方法和应用

权利要求书

1.HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：根据NCBI中金仓鼠的HDAC5基因序列，利用CRISPOR软件在HDAC5的第4个外显子区域设计gRNA序列：CCCGTAGCGCAGGGTCCATG；设计好的gRNA，合成、退火并连接至PX459质粒；测序正确的CRISPR质粒中抽备用；根据Invitrogen Lipofectamine 2000的标准转染程序，CRISPR质粒转染BHK-21细胞系，转染48h后加入终浓度3μg/mL的嘌呤霉素筛选5-7天后，进行细胞计数，分别铺100个和300个细胞，一周后单个细胞克隆形成后用克隆环挑取单克隆，转移至24孔板，扩大培养；收集不同细胞克隆分别在DNA水平和蛋白水平进行鉴定。

2.根据权利要求1所述的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：所用细胞系为贴壁培养型BHK-21细胞系；细胞培养在5％CO₂培养箱中，温度为37℃，DMEM培养基中添加有10％胎牛血清和1％抗生素penicilin-streptomycin。

3.根据权利要求1所述的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：DNA水平鉴定时用以下引物扩增：GT-FP TTCTCCTTGTTGCGCAGGAT，GT-RPTGTCTGGTAGTCTCCTGGGC，扩增产物进行Sanger测序；蛋白水平鉴定时用HDAC5的抗体利用Western blot检测HDAC5的蛋白表达水平。

4.根据权利要求1所述的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系的构建方法，其特征在于：得到HDAC5敲除细胞HDAC5-KO-A2，HDAC5-KO-A2在Cas9预定切割位置处有13个碱基的缺失，用Western blot检测内源HDAC5的蛋白表达水平，HDAC5-KO-A2细胞系不能检测到HDAC5的蛋白表达。

5.权利要求1-4中任一项所述方法构建的HDAC5基因敲除的BHK-21细胞系。

6.基于权利要求1-4中任一项所述方法得到的HDAC5基因敲除细胞系在制备口蹄疫疫苗中的应用。