[发明专利]一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法

说明书

本发明公开了一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法，属于动物传染病防治和生物技术领域。本发明基于BAC系统和同源重组一步克隆法拯救PDCoV CHN‑HN‑2014株重组病毒的反向遗传系统，将毒株的5个基因片段一步克隆至中间载体pBAC‑M‑PDCoV中，获得包含PDCoV CHN‑HN‑2014株全长cDNA的重组质粒pBAC‑CHN‑HN‑2014，转染细胞后拯救出重组病毒rCHN‑HN‑2014，从而建立了猪δ冠状病毒反向遗传操作平台，为深入研究PDCoV的感染和致病机制奠定了基础。同时，针对目前我国还没有可用的PDCoV疫苗的实际问题，本发明的PDCoV感染性克隆平台，还可以用于研制更加安全高效的新型PDCoV基因工程疫苗，该平台还可作为活病毒载体，用于多联疫苗的研制，因此本发明对于该病毒相关的研究具有重大价值。

技术领域

本发明属于动物传染病防治和生物领域。具体涉及一种猪δ冠状病毒感染性克隆质粒的构建方法。

背景技术

猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)属于冠状病毒科，δ冠状病毒属成员，有囊膜、基因组为单股正链RNA，是目前唯一一种成功分离的δ冠状病毒。Woo等人对香港地区2010-2011年采集自不同动物的样品进行冠状病毒检测时首次发现猪δ冠状病毒(Woo P.C.Y,Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses in thegenus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus.J.Virol.2012,86:3995-4008)。2014年初，PDCoV感染在美国首次爆发，并很快传至美国多个州，随后韩国、加拿大、中国、泰国、越南、老挝、日本等国家也相继报道检测到PDCoV(Wang L et al，Porcine coronavirusHKU15 detected in 9US states,2014.Emerg Infect Dis.2014,20(9):1594-1595；Saeng-Chuto K et al,Different Lineage of Porcine Deltacoronavirus inThailand,Vietnam and Lao PDR in 2015.Transbound Emerg Dis.2017,64(1):3-10)。到目前为止，国内外已有多个课题组分离到PDCoV，动物实验证实其对仔猪具有较强的致病性，能够导致仔猪出现呕吐、腹泻等典型的肠道疾病症状，剖检可见感染仔猪肠壁变薄、透明，盲肠、结肠扩张并伴有大量的黄色液体；组织病理学分析发现十二指肠、空肠、回肠绒毛严重萎缩(Ma Y M et al,Origin,evolution,and virulence of porcinedeltacoronaviruses in the United States.MBIO,2015,6(2):e00064；Dong et al,Isolation,genomic characterization,and pathogenicity of a Chinese porcinedeltacoronavirus strain CHN-HN-2014.Vet Microbiol.2016,196:98-106)。尽管与猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)相比，PDCoV感染引起的死亡率较低，但其往往与PEDV、TGEV存在混合感染的现象，从而引起更严重的临床症状，威胁着养猪业的健康发展。作为近年来新发现的猪肠道冠状病毒，体外传代的PDCoV毒株数量相对于PEDV仍然较少，对PDCoV的感染和致病性的机制了解也不是十分清楚，也没有可用的疫苗和特异性抗病毒药物，因此，进一步加大流行病学调查、临床毒株的分离以及致病机制的研究具有重要价值。