[发明专利]Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用

说明书

本发明公开了Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用。本发明发现了一种可作为卵菌转化筛选标记的抗生素—诺尔丝菌素。本发明通过将可引起卵菌对诺尔丝菌素抗性的编码基因Nat1作为筛选标记，用于大豆疫霉转化时转化子的筛选。该筛选标记的开发解决了卵菌转化时筛选标记单一的问题，为卵菌转化时基因回补、基因多敲除等方面的工作提供了有力保障。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用。

背景技术

卵菌(Oomycetes)是一种真核生物，目前,已发现至少1800种卵菌，大部分卵菌是植物、动物以及其他生物的病原菌，给人类造成了巨大的经济损失。植物病原卵菌主要包括霜霉(Downy mildews)、疫霉(Phytophthora)、腐霉(Pythium)和白锈病(Albugo)。与真菌相比，卵菌具有一些独特的生理生化特征，例如：菌丝没有或有很少的隔膜，营养体为二倍体，细胞壁的主要成分是纤维素等。

疫霉菌(Phytophthora)是指隶属于卵菌门(Oomycota)下的一类微生物，多数是植物病原菌。疫霉菌引起的病害给许多农作物和植物造成毁灭性危害，称为“植物疫病”。目前卵菌病害对农业生产的严重危害逐渐引起全世界的关注。不断释放的卵菌基因组序列信息，极大促进了卵菌的遗传研究，促使研究者开发新的遗传学操作工具，在病原卵菌中敲除和回补目的基因并鉴定其功能。

目前卵菌中可利用的筛选标记非常有限，唯一可靠的筛选标记是NPT II基因，其通过卵菌通用强启动子ham34启动编码的蛋白可使得卵菌对遗传霉素(G418)的抗性，从而使转化子被筛选出来。但是NPT II用于敲除体系时，因携带该标记的转化子具有G418抗性而不能被再次利用进行回补实验，导致对敲除转化子进行基因回补实验存在着没有新的筛选标记可用的问题。因此，开发新型卵菌转化筛选标记，对于卵菌基因功能的研究具有重要意义。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用，解决了现有卵菌基因回补实验中没有新的筛选标记可用的问题；而且，本发明的筛选标记对卵菌转化子具有较高的筛选效率。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

Nat1基因作为筛选标记在卵菌遗传转化中的应用；所述Nat1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，所述卵菌遗传转化具体为：以其他筛选标记获得的敲除转化子的卵菌基因回补突变体的筛选。

优选的，所述卵菌为大豆疫霉菌。

上述应用中，利用Nat1基因筛选卵菌基因回补突变体的方法，包括以下步骤：

(1)构建包含Nat1基因和目的基因的回补载体；

(2)利用PEG介导的原生质体转化系统将步骤(1)构建的回补载体转化到目的基因被敲除的卵菌原生质体，得到转化子；

(3)将转化子置于含有诺尔丝菌素(Nourseothricin，NTC)的培养基中进行培养，筛选能够正常生长的转化子作为回补转化子。

优选的，步骤(1)中，所述回补载体的构建方法为：将pTOR载体线性化，利用同源重组酶将Nat1基因连接于pTOR载体；将连接Nat1基因的pTOR载体使用ClaI、EcoRI内切酶将载体线性化，利用T4连接酶将目的基因连接于pTOR载体。

优选的，步骤(3)中，所述筛选具体为：

将转化子置于含有30μg/ml诺尔丝菌素的PM培养基，25℃黑暗培养3-4d；

观察培养基表面菌丝生长状况，在有菌丝长出的PM培养基上用含50μg/ml诺尔丝菌素的V8培养基覆盖，于25℃黑暗中培养3-4天；