[发明专利]基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统、方法及应用

说明书

本发明涉及基于CRISPR‑Cas14a的通用细菌和病毒检测系统、方法及应用。所述检测系统包括CRISPR‑Cas14a系统、TSPE和磁性纳米粒子；所述CRISPR‑Cas14a系统包括通用sgRNA和Cas14a；所述TSPE为标签特异性引物扩增体系，包括含有Tag序列的标签正向引物和含有生物素标记序列的反向引物；所述磁性纳米粒子可与TSPE的反向引物连接。本发明检测系统具有通用sgRNA，且检测过程不需要PAM，检测过程得到简化，应用范围更广。所述检测方法操作简单，相较于传统检测方法，省去了多次制备sgRNA的过程，简化了标签特异性引物扩增体系的纯化过程(TSPE)，降低了检测过程中的操作难度和生产成本。所述应用具体值本发明检测系统在检测无PAM序列DNA的中的应用。

技术领域

本发明涉及医药检测技术的技术领域，尤其涉及一种基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统、方法及应用。

背景技术

许多威胁生命的传染病通常具有相似的体征与症状，为了进一步确定如何用药，需要明确患者感染的细菌或病毒的具体种类。现今，核酸检测系统可用于鉴定细菌或病毒的种类，且具有高度灵敏、诊断速度快的优点。

在病毒和细菌检测领域中，常用的核酸检测系统主要依赖CRISPR-Cas系统。CRISPR-Cas系统(聚簇成规则间隔的短回文重复序列和相关蛋白)是细菌中的一种适应性免疫系统，可整合入侵的外源DNA；当病原体再次入侵时，转录形成crRNA，crRNA与Cas酶形成核糖核蛋白复合物，该复合物与外源DNA上的特定核酸序列(靶核酸序列)配对并切割，使病原体灭活。结合CRISPR-Cas系统的上述性质，再辅以通用荧光核酸传感平台，即可用于病原体的检测。

目前，基于CRISPR-Cas系统的核酸检测系统主要包括基于CRISPR-Cas9的核酸检测系统和基于CRISPR-Cas13a/Cas12a的核酸检测系统。这两种检测系统均已应用于临床的核酸检测、区分致病菌种；但是，使用时需要至少满足以下两点：

(1)需要靶核酸序列中的Protospacer相邻基序(PAM)；

(2)使用多重sgRNA进行多目标检测时，需要各待测病原体基因组片段中的特定目标和根据不同病原体的特定片段制备的多种sgRNA。

上述条件都限制了基于CRISPR-Cas系统的核酸检测系统的应用，增大了检测难度和检测成本；同时，也凸显出了对不使用PAM、通用sgRNA的CRISPR-Cas核酸检测系统的需求。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的之一在于提供一种基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统，其具有通用sgRNA，且检测过程不需要PAM，检测过程得到简化，应用范围更广，实用性强。

为实现上述目的，本发明提供了一种基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统，包括CRISPR-Cas14a系统、TSPE和磁性纳米粒子；所述CRISPR-Cas14a系统包括通用sgRNA和Cas14a；所述TSPE为标签特异性引物扩增体系，包括含有Tag序列的标签正向引物和含有生物素标记序列的反向引物；所述磁性纳米粒子可与TSPE的反向引物连接。

进一步的，所述通用sgRNA序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述CRISPR-Cas14a系统还包括探针DNA，所述探针DNA修饰有荧光基团和猝灭基团。

进一步的，所述TSPE还包括目标DNA模板。

进一步的，所述磁性纳米粒子为链霉亲和素磁珠。

本发明基于CRISPR-Cas14a的通用细菌和病毒检测系统的有益效果为：