[发明专利]一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）以花生半粒种子为外植体，使用含乙酰丁香酮的农杆菌侵染液体侵染；

2）侵染后的半粒种子在含有二硫苏糖醇的共培养基上暗培养3 天；所述共培养基为添加乙酰丁香酮的MS基本培养基；

3）转入丛生芽筛选培养基中培养1周；所述的丛生芽筛选培养基为添加赤霉素、6-苄基嘌呤、头孢噻肟、棒酸羧噻吩青霉素和选择标记抗生素的MS基本培养基；

4）转入生根培养基中培养至根系长度＞5 cm，提取叶片DNA进行PCR检测；所述生根培养基为添加头孢噻肟、棒酸羧噻吩青霉素、萘乙酸和乙哚丁酸的MS基本培养基；

步骤1）中所述的花生半粒种子的制备：将冲洗后的种子浸泡于无菌水中，在黑暗条件下浸泡24 h，之后，剥去种皮，使用无菌解剖刀沿着种子纵向切开，使每半粒种子均带有一半胚，再将半粒种子横向切割，保留含有胚的部分，去除没有胚的子叶部分；

步骤1）中乙酰丁香酮的浓度为100 µmol/L；

步骤2）中二硫苏糖醇的浓度为1.0 mmol/L；

步骤2）中所述的共培养基配方为：MS基本培养基 + 100 µmol/L乙酰丁香酮，PH为5.8；

所述的共培养基、丛生芽筛选培养基和生根培养基中均添加200 mg/L天冬酰胺和200mg/L 谷氨酰胺。

2.根据权利要求1所述的农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，其特征在于，步骤1）中选择OD₆₀₀值为0.7-0.8的农杆菌侵染液，侵染的时间为25 min。

3.根据权利要求1所述的农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，其特征在于，步骤3）中所述的选择标记抗生素为卡那霉素。

4.根据权利要求3所述的农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，其特征在于，步骤3）中所述的丛生芽筛选培养基的配方为MS基本培养基 + 20 µmol/L 6-苄基嘌呤 + 1 µmol/L赤霉素 + 300 mg/L 头孢噻肟 + 300 mg/L 棒酸羧噻吩青霉素 + 50 mg/mL 卡那霉素，PH为5.8。

5.根据权利要求1所述的农杆菌介导的花生快速遗传转化方法，其特征在于，步骤4）中所述的生根培养基配方为：MS基本培养基 + 300 mg/L头孢噻肟 + 300 mg/L 棒酸羧噻吩青霉素 + 1 mg/L 萘乙酸 + 0.2 mg/L 乙哚丁酸，PH为5.8。