[发明专利]一种重组人白介素-6的制备方法

权利要求书

1.一种重组人白介素-6的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)原核表达方式制备重组人白介素-6包涵体；

(2)采用含尿素的洗涤缓冲液A清洗重组人白介素-6包涵体，再用洗涤缓冲液B洗涤重组人白介素-6包涵体以除去尿素，离心收集固体，所得固体为初步纯化后的重组人白介素-6包涵体；

(3)初步纯化后的重组人白介素-6包涵体加入含有β-巯基乙醇的变性液中，至重组人白介素-6包涵体完全溶解，缓慢加入复性液使重组人白介素-6低温静置复性，再进行透析和超滤浓缩，得到复性的重组人白介素-6；

(4)使用填充Anti-IL-6高亲和吸附介质的亲和吸附柱对复性的重组人白介素-6进行亲和纯化，得到重组人白介素-6。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中原核表达方式制备重组人白介素-6包涵体的具体方法包括如下步骤：将重组人白介素-6序列导入pET-21a或pET-24a表达载体中制成重组质粒，将重组质粒转化至E.coli BL21或E.coli ShuffleT7中，扩大表达，收集高效表达重组人白介素-6的菌体用IPTG诱导剂诱导，收集菌体并将菌体破碎至菌液相对透明、不再粘稠，收集沉淀即为重组人白介素-6包涵体。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中的洗涤缓冲液A为10-50mMTris-HCl，1-4M尿素，80-200mM NaCl，pH＝8-9；洗涤缓冲液B为10-50mM Tris-HCl，pH＝8-9。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述含有β-巯基乙醇的变性液为6-8M盐酸胍，100-200mM NaCl，1-1.5‰β-巯基乙醇的混合溶液或浓度大于8M的尿素，100-200mM NaCl，10-15mM DTT的混合溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述复性液为0.5-1.5M盐酸胍，50-150mM Tris-HCl，8-12mM EDTA，0.25-0.5mM GSSG(氧化型)，2.5-5mM GSH(还原型)，300-700mM精氨酸，2-5％甘油，pH＝8-9；加入复性液的速度为0.1-0.5mL/min；4-6℃静置20-40h。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中透析所用透析外液为10-50mM Tris溶液。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)中亲和纯化的方法为：将步骤(3)所得复性的重组人白介素-6溶液以0.2-1mL/min流过以高亲和力Anti-IL-6抗体为亲和配基，CL-6B琼脂糖凝胶微球为固载介质的亲和吸附柱，用PBS溶液平衡亲和吸附柱；采用pH＝1.5-2的Gly-HCl溶液对吸附柱进行洗脱，将洗脱的重组人白介素-6蛋白用超滤管以超滤换液的方式置换到pH＝8-9的10-50mM Tris-HCl溶液中，即得纯化后的重组人白介素-6。