[发明专利]单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用

说明书

本发明提供了一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用，涉及生物检测技术领域。本发明提供的单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，首先分别提取单增李斯特菌标准品、待测样品和非目标菌株的DNA，然后将得到的DNA进行微滴数字PCR扩增得到反应液，最后对反应液进行检测和分析，其中微滴数字PCR扩增的探针具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列，引物具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，该引物对单增李斯特菌的扩增具有较好的特异性，能对食品中单增李斯特菌含量进行准确测定。本发明的检测方法简单，周期短，灵敏度高、精密度高、稳定性良好，且与大肠杆菌等均无交叉反应。

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法及其应用。

背景技术

微滴数字PCR(Droplet digital PCR，ddPCR)是新型核酸定量检测技术，与传统定量PCR(qPCR)技术不同，微滴数字PCR采用绝对定量的方式，不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测目标序列的拷贝数，检测极限可达单拷贝，具有比传统RT-PCR更加出色的灵敏度、特异性和精确性。微滴数字PCR技术在痕量核酸样本检测、复杂背景下稀有突变检测和表达量微小差异鉴定方面具有极大的优势。

单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)，简称单增李斯特菌(L.M)，属于李斯特菌属，是一种人畜共患病的致病菌。其引起的主要疾病包括细菌性脑膜炎、败血症、心肌炎、骨髓炎，甚至导致孕妇流产以及新生儿感染。单增李斯特菌的主要特征之一是可在低温下生长，在零下20℃的环境下仍能存活1年，0～45℃都能生存，在冰箱冷藏室4～6℃的温度下仍能大量繁殖，所以就有“冰箱杀手”的称号。根据美国疾病控制与预防中心(Centersfor Disease Control and Prevention，CDC)统计，在美国平均每一年约有1600～2000例单增李斯特菌食物中毒事件发生，虽然该菌致病率并不是很高，但其致死率却很高，对成年人的致死率高达20％～60％，而对新生儿则可达54％～90％。故而针对食品中单增李斯特菌的检测对于保障食品安全是极为重要的。

目前常用检测方法有传统生物学检测，包括EB增菌法和LB增菌法，通过微生物的分离培养、生化反应、溶血试验、协同溶血试验、动物试验等，这些实验设备要求不高，可操作性强，但检验周期长，需6d-7d，这种传统的检测方法已无法满足食品生产过程中的在线检测、食品上市和消费前的快速检测的要求；传统的免疫学检测方法，如ELISA检测方法，现在已有德国拜发公司生产的商品化的单增李斯特菌检测试剂盒可供使用，用ELISA方法操作较简单，依赖抗体的品质，特异性强，但检测限相对较高，由于单克隆抗体制备昂贵，所以用ELISA试剂盒进行多种食品样品的检测费用较高；还有常用的RT-PCR方法，虽然具有灵敏度高，检测时间短，并且可定量检测的优势，但其定量依赖于标准曲线，检测限尚不能检测单拷贝并且对于操作要求高，容易产生假阳性和假阴性等问题。因此建立食品中单增李斯特菌的微滴数字PCR(ddPCR)检测方法可以有效解决食品安全检测中传统方法的灵敏度不足、检测精度不高、检测周期长、操作繁琐等问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，该检测方法操作简单、检测周期短、检测精度高、灵敏度好，能够解决上述问题中的至少一种。

本发明的第二目的在于提供一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法在食品检测中的应用。

为了解决上述技术问题，特采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种单增李斯特菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：分别提取单增李斯特菌标准品、待测样品和非目标菌株的DNA，然后将得到的DNA进行微滴数字PCR扩增得到反应液，最后对反应液进行检测和分析；

所述微滴数字PCR扩增的引物具有如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列；