[发明专利]一种HPA和HLA抗原系统的同步检测试剂盒及方法

权利要求书

1.一种HPA和HLA抗原系统的同步检测试剂盒，其特征在于：所述HPA和HLA抗原系统的同步检测试剂盒包括具有SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.498所示核苷酸序列的探针。

2.一种HPA和HLA抗原系统的同步检测方法，其特征在于：所述方法用于同步捕获血小板膜糖蛋白基因CD109、GP1BA、GP1BB、ITGA2、ITGA2B、ITGB3和人类白细胞抗原HLA-A、HLA-B、HLA-C基因的全长编码区序列，并对捕获的基因序列片段进行文库制备、Illumina平台测序上机以及生物信息学分析，实现对HPA抗原系统和HLA-A、-B、-C抗原系统的基因单孔同步高通量测序，主要包括以下步骤：

S1、HPA抗原系统所在的6个血小板膜糖蛋白基因CD109、GP1BA、GP1BB、ITGA2、ITGA2B和ITGB3的捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～427所示；HLA抗原系统中的HLA-A、HLA-B、HLA-C基因的捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.428～498所示；所有捕获探针的5’端偶联生物素且混合待用；

S2、制备人基因组DNA；

S3、使用超声波物理打断法对人基因组DNA进行片段化，以使得平均片段大小为350bp；

S4、将步骤S3得到的片段进行末端修复、加A尾及磁珠纯化；

S5、将步骤S4得到的片段末端连上index接头，并进行磁珠纯化；

S6、将步骤S5得到的片段进行PCR扩增，扩增产物磁珠纯化，采用Qubit DNA双链定量测定试剂准确定量；

S7、将步骤S6得到的纯化片段与步骤S1中的捕获探针进行液相杂交捕获反应；

S8、将步骤S7得到的液相杂交产物利用链霉亲和素偶联磁珠纯化，捕获与探针杂交的片段；

S9、将步骤S8获得的捕获产物进行PCR扩增，扩增产物磁珠纯化，获得捕获文库；

S10、将步骤S9获得的文库通过Aligent 4200电泳仪进行质量检测，分析文库片段的大小、质量，并通过Qubit DNA双链定量测定试剂准确定量；

S11、采用Illumina测序试剂，将步骤S10获得的文库于Illumina Miseq平台上测序；

S12、将步骤S11得到的FASTQ原始数据进行生物信息学分析，指定个体HPA抗原系统基因型和HLA-A、HLA-B、HLA-C基因型。

3.根据权利要求2所述的HPA和HLA抗原系统的同步检测方法，其特征在于：所述步骤S3中超声波物理打断法对人基因组DNA进行片段化程序：

采用Diagenode Bioruptor^TMPico打断仪，取200ng基因组DNA，10mM pH8.0 Tris-HCl补至50μL；置冰上预冷15min，放入片段化仪器，运行参数为：工作30s，间歇30s，共13个循环。

4.根据权利要求2所述的HPA和HLA抗原系统的同步检测方法，其特征在于：所述步骤S4和S5文库制备中的片段末端修复、加A尾及index接头试剂为VariantBaits^TMlibrary prepkit，其中的index适配Illumina测序平台，磁珠纯化所需的磁珠为XP磁珠。

5.根据权利要求2所述的HPA和HLA抗原系统的同步检测方法，其特征在于：所述步骤S6和S9中：PCR扩增试剂为KAPA HiFi HotStar ReadyMix试剂，磁珠法纯化所需的磁珠为XP磁珠。

6.根据权利要求2所述的HPA和HLA抗原系统的同步检测方法，其特征在于：所述步骤S7中：液相杂交试剂为VariantBaits^TMlibrary prep kit试剂。

7.根据权利要求2所述的HPA和HLA抗原系统的同步检测方法，其特征在于：所述步骤S8中：链霉亲和素偶联磁珠为Invitrogen公司的Dynabeads Streptavidin T1 MagneticBeads。