[发明专利]一种基于质谱的活细胞内ROS绝对定量方法及其应用

说明书

本发明提供了一种对活细胞内的活性氧含量进行绝对定量的方法及其应用。分子探针DCFH‑DA进入细胞后在细胞的活性酯酶作用下分解为DCFH；DCFH被活细胞内的ROS转化为DCF；通过质谱实现对DCF的绝对定量，继而定量活细胞中的ROS。本发明提供的活性氧绝对定量方法具有极低的检出限，易被细胞摄取、细胞毒性低、对死亡细胞和检测背景中的活性氧不具有响应等特点。将该探针利用于循环肿瘤细胞，不仅可以对胰腺癌循环肿瘤细胞进行活性区分，还可对循环肿瘤细胞中的ROS含量进行绝对定量，并将其与患者的临床表征进行联系，为肿瘤患者的临床诊断和治疗提供宝贵信息。

技术领域

本发明涉及生物领域，具体地，涉及一种基于质谱的活细胞内ROS绝对定量方式及其应用。

背景技术

ROS被定义为细胞中不完全的氧代谢产物。一方面其在细胞的众多生理学过程(如细胞生长、分化、老化、凋亡等)中发挥着重要的作用，另一方面，在许多病灶部位的细胞中同时普遍存在含量异常的细胞ROS。胞内ROS的定量有助于对这些ROS相关疾病的早期诊断和分期，也是了解其在各种生理和病理途径中发挥角色作用机制的必然门槛。

目前已经报道了多种评估细胞内ROS含量的方法，包括电化学发，荧光发和正电子发射断层扫描(PET)等，但大多数的细胞内ROS定量只可以实现半定量目的，而几乎很少有方法可以实验对细胞内ROS的绝对定量，且易受到凋亡细胞及检测背景等中的非目标性ROS的影响。

液相色谱-质谱法(LC-MS)被广泛用于医学诊断，成分分析和物质检测中，具有很高的灵敏度。因此我们希望基于具有活细胞内ROS响应特性的探针DCFH-DA，尝试开发一种通过三重四级杆质谱对活细胞中的ROS进行绝对定量的方法，从而克服上述方法对ROS定量的缺点。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种基于质谱的活细胞内ROS绝对定量方法。

根据本发明提供的一种基于质谱的活细胞内ROS绝对定量方法，包括如下步骤：

分解步骤：分子探针DCFH-DA进入细胞后在细胞的活性酯酶作用下分解为DCFH；

转化步骤：DCFH被活细胞内的ROS转化为DCF；

定量步骤：通过质谱实现对DCF的绝对定量，继而定量活细胞中的ROS。

优选地，所述分子探针DCFH-DA具有ROS响应特征。

优选地，所述质谱包括超高效液相色谱-三重四级杆质谱。

优选地，细胞内ROS的定量值和细胞计数在细胞数大于等于100个时存在线性关系。

优选地，所述质谱包括超高效液相色谱-三重四级杆质谱的条件为ESI负离子模式；气帘气：35psi；离子化电压：-4500V；去溶剂温度：500℃；雾化气：55psi；辅助加热气：55psi；采用多重反应监测对样品进行分析。

根据本发明提供的一种基于上述的基于质谱的活细胞内ROS绝对定量方法的应用，应用于恶性实体瘤外周的血循环肿瘤细胞。

优选地，所述恶性实体瘤包括胰腺癌、胃癌、肺癌、结肠癌、肝癌、膀胱癌、乳腺癌或者前列腺癌。

优选地，DCF对循环肿瘤细胞活性进行区分。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明提供的活细胞内ROS绝对定量分时，具有灵敏度高，细胞毒性低，对背景和死亡细胞中的ROS不具有响应性等特点。

2、本发明能够应用于细胞中的ROS定量，ROS的定量水平和细胞计数在细胞数低至100时仍保持良好的线性关系。

3、本发明能够应用于恶性实体瘤的循环肿瘤细胞，可以对细胞中的ROS进行定量分析。