[发明专利]具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用

说明书

本发明公开了一株具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体及其应用。所述的单克隆抗体是由保藏编号为CGMCC No.13840的杂交瘤细胞分泌产生。所述的单克隆抗体具有广谱性，能够有效中和PEDV‑LNCT2、PEDV‑LNSY和PEDV‑Hjms等G2基因亚型毒株，使其失去感染细胞的能力，也能够中和CV777毒株(G1基因亚型)。鉴于该单克隆抗体的生物学特性以及所具有的广谱性中和PEDV毒株的能力，该单克隆抗体可用于建立一系列包括阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条等方法在内的PEDV诊断方法，具备广阔的应用价值和研究价值。

技术领域

本发明涉及一种单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。特别涉及一种具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体、分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。本发明属于生物技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus,PEDV)是养猪业中引发仔猪腹泻、消瘦、脱水的重要病原体之一，给养猪业带来重大经济损失。研究表明，PEDV有两个基因亚型，即G1和G2亚型。2010年之前，PEDV流行毒株以G1亚型为主，2010年之后，PEDV流行毒株以G2亚型为主。基因序列分析表明，PEDV G1和G2亚型的主要差异在S基因上。G1亚型毒株S基因由4152nt构成，编码1383个氨基酸，而G2的S基因为4161nt构成，编码1386个氨基酸，在基因长度上增加了9个碱基。基因内部也存在较大差异。PEDV基因组中最大的变异位于S基因，而S基因中的突变主要集中在N末端。NPL-PEDV/2013/P10与NPL-PEDV/2013相比，ORF1a/b蛋白、核蛋白、NS3B、膜蛋白以及囊膜蛋白在氨基酸水平上完全一致。而在纤突蛋白(S)中含有六个核苷酸多态性，导致氨基酸位点变化：F375L、T486P、D856E、A1081V、A1099S以及Y1253D。在S1区域有2个氨基酸变异，在S2区域有4个氨基酸变异(Lawrence et al.,2014)。冠状病毒S蛋白能够诱导中和性抗体的产生，S基因变异必然会导致S蛋白诱导产生的中和性抗体在中和病毒方面上存在差异。

因此，获得一株具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体，对于猪流行性腹泻病毒的防治具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在提供一种具有广谱性中和猪流行性腹泻病毒的单克隆抗体、分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明以纯化的猪流行性腹泻病毒(PEDV)流行毒株LNCT2的病毒粒子为抗原，免疫BALB/c小鼠，获得1株稳定分泌抗PEDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为5F7。经鉴定，该杂交瘤细胞培养上清和腹水抗体效价分别为1：1000和1:100000。5F7单抗亚类为IgG2a，轻链为κ型。IFA(间接免疫荧光检测)检测发现，5F7单抗与病毒发生反应；Westernblot结果显示，5F7单抗与PEDV粒子、S蛋白均发生反应；上述两种结果表明该单抗的抗原表位为线性表位，抗原表位位于S蛋白的1261aa～1386aa之间。PEDV S蛋白根据结构和功能可分为S1和S2两个区域，其中S1区域含有病毒入侵细胞的受体结合区域，该区域也是诱导机体产生中和性抗体的关键区域；S2区域的主要功能为介导病毒与细胞发生膜融合。经抗原表位鉴定发现，5F7抗体的抗原表位位于S2区域。该抗体是首个针对PEDV S2区域的中和性抗体，具有广谱性。病毒中和实验也表明，该单抗能够有效中和PEDV-LNCT2、PEDV-LNSY和PEDV-Hjms等G2基因亚型毒株，使其失去感染细胞的能力，也能够中和CV777毒株(G1基因亚型)。鉴于该单抗的生物学特性，该单抗具有广谱性中和PEDV毒株的能力，该抗体可用于建立一系列阻断ELISA、捕获ELISA、间接ELISA、竞争ELISA和胶体金试纸条等诊断方法，具备广阔的应用价值和研究价值。