[发明专利]一种去除有核红细胞的血液单细胞悬液的制备方法

说明书

本发明公开一种去除有核红细胞的血液单细胞悬液的制备方法，抽取新鲜的有核红细胞血液至含有50uL EDTA‑K2的无酶无菌离心管中，20℃孵育10min，随后离心弃血浆；向离心管中加入预冷的有核红细胞裂解液，孵育后离心弃上清；向离心管中再加入预冷的有核红细胞裂解液，孵育后离心弃上清；再向离心管中加入无酶无菌PBS，利用细胞计数仪或血球计数板检测细胞浓度，并通过台盼蓝染色计算细胞活率，加入合适体积无酶无菌PBS用于稀释单细胞悬液，使细胞终浓度满足10x Genomics上机操作。本方法能够实现低成本、快速、高效地获得去除有核红细胞的血液单细胞悬液，并保证其它血细胞保持良好活力。

技术领域：

本发明属于动物细胞生物学技术领域，具体涉及一种去除有核红细胞的血液单细胞悬液的制备方法。

背景技术：

血细胞是动物机体免疫的重要组分。脊椎动物的血细胞主要包括：红细胞、白细胞和血栓细胞。白细胞又分为粒细胞、单核细胞和淋巴细胞，其中粒细胞又分为中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞。目前，研究者主要通过细胞化学染色、流式细胞术和荧光染色技术来辨别血细胞类型，这些技术的局限性在于只能通过已知的标记来区分血细胞类型，无法定义新的血细胞类型及生物标记。

单细胞测序(Single-Cell Sequencing)是目前应用最广泛的高通量测序技术之一，其中单细胞转录组测序一个重要的研究内容就是利用Marker基因分辨组织细胞异质性，在单细胞分辨率下重新定义细胞类型，并根据每个细胞的基因表达量挖掘新的细胞亚群和Marker基因。因此利用单细胞转录组测序可以完善物种的血细胞图谱，为血液学研究提供坚定的理论基础。目前，在人类、大鼠和小鼠上，已有文献报道可利用淋巴细胞分离液分离出血液中的淋巴细胞，进而利用单细胞转录组测序进一步定义淋巴细胞亚群。

鉴于脊椎动物血液中红细胞异质性极小但占比极大，理论上可裂解红细胞后再进行单细胞转录组测序，从而可以避免单细胞悬液中大量的红细胞对测序结果的影响。然而目前商品化的红细胞裂解液仅可裂解无细胞核的成熟红细胞，无法裂解鸟类和龟类等物种的有核红细胞。综上所述，建立一种去除有核红细胞的血液单细胞悬液的制备方法，对于完善鸟类和龟类等有核红细胞物种的血细胞图谱至关重要。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种去除有核红细胞的血液单细胞悬液的制备方法，解决了以上背景技术的不足之处，本方法获得的单细胞悬液无有核红细胞，且细胞数量多、活率高。

为了实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：一种去除有核红细胞的血液单细胞悬液的制备方法，如下：抽取0.5mL新鲜的有核红细胞血液加入至含有50μL EDTA-K2的无酶无菌1.5mL离心管中，20℃孵育10min，随后3000rpm、4℃离心10min，弃血浆；向离心管中加入1mL 4℃预冷的有核红细胞裂解液，4℃孵育10min，随后3000rpm、4℃离心10min，弃上清；向离心管中再加入1mL 4℃预冷的有核红细胞裂解液，4℃孵育5min，随后3000rpm、4℃离心10min，弃上清；再向离心管中加入0.1mL 4℃预冷的无酶无菌PBS轻微吹打重悬离心管底部的白色沉淀，利用细胞计数仪或血球计数板检测细胞浓度，并通过台盼蓝染色计算细胞活率，加入合适体积的4℃预冷的无酶无菌PBS用于稀释单细胞悬液，使细胞终浓度满足10x Genomics上机操作。

本发明还具有如下技术特征：

1、所述的PBS不包含钙离子和镁离子，且pH＝7.4。

2、所述的有核红细胞裂解液配制方法：按如下固液配比分别称取0.823736gNH₄CL、0.10012g KHCO₃和0.0037224g EDTA溶解在100mL去离子水中，4℃溶解过夜，用0.22μm滤膜过滤至无酶无菌的15mL离心管中，-20℃保存。