[发明专利]基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用

说明书

本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及基于NtFER的改造在提高植物抗性中的应用。本发明以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造，下调NtFER基因的表达量，提高植物对青枯病抗性。具体以烟草NtFER基因为靶标，设计了CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中，然后转化烟草，获得了烟草NtFER基因的编辑材料，并发现其对青枯病具有明显的抗性。

技术领域

本发明属于植物病害防治技术领域，具体涉及基于NtFER基因的改造在提高植物抗性中的应用。

背景技术

FERONIA(FER)为植物界保守的一类受体蛋白激酶，在植物中的发现其具有响应生物胁迫和非生物胁迫的功能，包括冷热胁迫，盐胁迫，病原菌胁迫等。尤其近年来发现其配体分子RALF23能够通过FERONIA抑制植物免疫系统，而在植物根部，根结线虫通过分泌RALF类似物与FERONIA竞争结合，从而达到抑制植物免疫系统的作用，因此FER在植物免疫调控中发挥重要的作用。烟草中，目前发现NtFER主要参与烟叶大小和香气物质的调控过程。

青枯病是由假单胞杆菌科(Burkholderiaceae)青枯菌属(Ralstonia)青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)侵染引起的一种土传细菌病害，寄主范围广，可侵染烟草、番茄、马铃薯、辣椒等百种植物。烟草青枯病主要发生在热带和亚热带等地区，是烟草生产上一大毁灭性土传病害。烟草青枯病在化学、生物防治等方面仍然存在多方面的问题，且青枯菌系变异类型多，侵染来源较为复杂，因此挖掘青枯病抗性基因、培育抗性品种是防治青枯病的有效方法。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是：如何利用基因工程手段改造NtFER基因从而用于防治植物青枯病。

本发明的技术方案为：挖掘到与烟草青枯病抗性相关的NtFER基因，以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造，设计了CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中，然后转化烟草，获得了烟草NtFER基因的编辑材料，并发现其对青枯病具有明显的抗性。

本发明解决其技术问题是通过以下技术方案具体实现的：

基于NtFER基因的改造在提高植物青枯病抗性中的应用，所述应用的具体方法为：基于NtFER基因的改造，下调NtFER基因的表达量，从而达到提高植物对青枯病的抗性。

优选地，所述植物为烟草。

所述NtFER基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述NtFER基因编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:4所示。

基于NtFER基因的改造的具体方法：以烟草NtFER基因为靶标，通过基因工程手段进行改造。

优选地，所述基因工程手段包括诱变、基因编辑、基因沉默的至少一种方式。

优选地，基因编辑的具体方法为：以烟草NtFER基因为靶标，设计基于CRISPR/Cas9的sgRNA序列，将含有编码上述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体中转化烟草，实现对烟草NtFER基因的基因编辑。

优选的，所述基因编辑包括碱基取代、碱基缺失、碱基增加。

优选地，所述sgRNA的DNA片段连入CRISPR/Cas9载体的操作步骤为：

(1)退火：将SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3序列退火，反应体系：5×AnnealingBuffer for DNA Oligos 4μL，上下游引物各4μL(50μmol/μL)，Nuclease-free water补至20μL；反应程序：95℃5min，每8s下降0.1℃，直至25℃；4℃保存退火反应得到的DNA产物；