[发明专利]一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用

说明书

本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用。所述检测方法包括如下步骤：获取细胞计数板上共培养样品的显微图像，所述共培养样品为靶细胞与效应细胞共培养得到的细胞样品，所述靶细胞携带第一荧光标记，所述共培养样品至少使用一种第二荧光标记进行染色标记，所得显微图像包括明场显微图像、第一荧光显微图像和至少一张第二荧光显微图像，而后，对所述明场显微图像、所述第一荧光显微图像及所述至少一张第二荧光显微图像进行叠加合成分析并计数，得到细胞杀伤效力的检测结果。该检测方法能够同时得到待测细胞的图像信息和数据处理结果，所得结果更加直观，检测步骤少且检测效率高。

技术领域

本发明属于细胞杀伤活性检测技术领域，具体涉及一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用。

背景技术

细胞杀伤效力的检测对于免疫细胞治疗产品的质量控制具有重要的意义。由于免疫细胞治疗产品具有起始个体差异大、制备工艺规模化程度低、制剂多为活细胞产品、作用机制不是很明确等，使得这类产品的一致性差、批量有限、效期短、同一类产品的可比性差等特点，所以免疫细胞治疗产品的质控研究较为复杂，其中杀伤效力质量控制便是难点之一。

目前，常用的细胞杀伤检测方法有镉51释放实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放法、BATDA法、CAM法、CytoTox-Glo法和PKH法等。例如，镉51释放实验、LDH法、BATDA法和CytoTox-Glo法都属于间接法，即先用某一试剂对靶细胞进行标记，然后和不同浓度的免疫细胞进行孵育，当靶细胞受到免疫细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，这些物质会释放到上清中，通过测定释放物质的含量可以测定免疫细胞的活性。上述方法都是通过释放物质含量的测定而间接进行定量，反应时间的长短、仪器检测的时间点都会对读取的数值造成影响。

其中经典的方法是镉51释放实验，该方法可重复性好，但是，因其使用同位素标记靶细胞，从而存在半衰期短、同位素废弃物处理及实验防护要求高等多种限制因素，尤其是放射性同位素的使用对健康以及环境具有巨大威胁，其他放射性同位素标记靶细胞如H3亦具有此类缺陷，使该类方法的应用受到局限，因此，很多研究者会采用其它替代方法进行生物学效力检测。

传统的LDH法灵敏度及可重复性不稳定，且所需时间较长，批间变异较大，不能适应免疫细胞效期短的特点。CAM法及PKH法是通过流式细胞仪检测活细胞标记及死亡标记双信号来反映其杀伤效率，与前述方法相比，这两种方法所反映的信号还包括处于凋亡状态的细胞。

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)是一种在液流系统中快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集的技术。鉴于其在单细胞水平上高效准确的定量分析优势，目前涌现出多种以流式细胞术为基础的NK细胞杀伤活性的测定方法，但仍然存在缺陷。由于效应细胞和靶细胞在共培养过程中，靶细胞对效应细胞可能会产生一定抑制和破坏作用，则共培养体系的死亡率可能是包括靶细胞和效应细胞的共同死亡率。其次，尽管流式细胞术能够特异性地检测靶细胞的凋亡率，流式细胞仪属于液流系统，无法采集到细胞图像，若需要验证结果的准确性，还需要借助显微镜或其他仪器观察。

此外，在进行病人的免疫水平评价，肿瘤治疗愈后评价，以及细胞治疗过程中的免疫细胞的增殖能力评价等环节中，也都需要对免疫细胞的杀伤能力进行评估。

因此，开发一种直观地、准确地检测杀伤效力的检测方法，对于免疫细胞制品的研发或免疫细胞疗法的发展具有重要的意义。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法、系统及其应用。所述方法先通过对靶细胞和免疫细胞进行荧光染色，区分活靶细胞、死靶细胞、活效应细胞和死效应细胞，并结合荧光显微成像和图像合成分析方法，根据对应细胞个数计算得到细胞杀伤率。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种细胞杀伤效力的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：