[发明专利]一种待鉴定细胞单克隆源性的鉴定方法、系统及其应用

说明书

本发明提供一种待鉴定细胞单克隆源性的鉴定方法、系统及其应用。所述鉴定方法包括：在高通量细胞分析系统的明场和/或荧光通道下对孔板上多个样品孔中的待鉴定细胞进行显微成像，并获取显微图像；基于所述显微图像分析所述待鉴定细胞的生长状况，鉴定所述待鉴定细胞的单克隆源性；其中，所述鉴定方法包括在至少两个时间点对所述待鉴定细胞进行显微成像，且所述时间点包含培养第0天。本发明提供的方法可以提供直接的影像证据，连续拍照可逆向追踪，提供不同时间点的细胞生长信息；且一旦确定单克隆源性，无需第二轮有限稀释，能够明显缩短开发时间。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及待鉴定细胞的制备和筛选，尤其涉及一种待鉴定细胞单克隆源性的鉴定方法、系统及其应用。

背景技术

工程细胞的单克隆源性是产品表达和质量均一性的前提和保证，因此得到了越来越多的重视。当前，药物在审评过程中，需要采用合适的实验手段证明其所使用细胞的单克隆源性，并要求进入临床三期的药品必须提供细胞系的单克隆源性证据。

目前，常用的单克隆获取方法主要包括：有限稀释法(Limiting DilutionCloning，LDC)、半固体培养基挑取以及流式细胞荧光分选技术(Flourescent-activatedcell sorting，FACS)。

有限稀释法是传统的挑选单克隆的方法，该方法操作简单，对仪器设备的需求比较少，并且方便与成像系统关联使用，因此，有限稀释法是目前应用较多的单克隆挑选方法；其缺点是效率比较低，需要在大量的96/384孔板中进行挑选才有可能获得理想的克隆(一般认为在不低于1,000个克隆中挑选)，其所需时间较长、耗费人工，需要在显微镜下靠肉眼逐孔鉴定单克隆源性。

半固体培养基挑取，挑出的克隆可能是混合细胞群体，且需要额外的筛选压力(如药物抗生素等)、多次亚克隆和染料标记，虽然该方法容易获取荧光强度较好且准确度较高的单克隆源，但都会对细胞造成伤害，挑出的荧光信号强的目的克隆往往和最终产物产量的高低也不具有非常好的相关性。由于细胞是生长在半固体培养基中，后期还需要再进行驯化。

FACS法原理是根据细胞大小、荧光染料和细胞表面marker等因素挑选出所需要的单细胞，当前广泛应用于单细胞分离，稀有细胞分选等多项研究中，一般而言，该法可用于鉴定、分离具有高水平膜蛋白表达的细胞。FACS法在应用于挑选单克隆时，需要通过条件优化，使挑选的细胞与孔板的孔一一对应。在整个筛选过程中，细胞的形态及状态会对条件和分离效果产生影响，流式细胞仪在分选过程中细胞容易聚集成团，细胞活性低，且需要用染料标记，对细胞有伤害，分选结束后，单克隆在孔板内的克隆形成率也具有不确定性且无法得到克隆源的有效图片，仍需要使用显微成像系统进行拍摄并靠肉眼逐孔鉴定单克隆源性，并且由于流式细胞荧光分选技术和半固体培养基挑选对细胞的一些影响，所以很多开发者仍然使用传统的有限稀释法来鉴定。

此外，工程细胞在传代过程中有可能发生基因型和表型的突变，即使同一细胞来源的细胞库也很可能存在不均一性。一般细胞库的不均一性由两种原因导致：一是细胞库本身不是来源于一个细胞；二是细胞库来源于一个细胞，但有一个细胞发生突变，并在细胞库形成了亚群，虽然这些亚克隆序列的异质性可能不会影响工艺的一致性和稳健性。但是有些情况下，即使是单克隆来源细胞也难以作为稳定的工程细胞用于生产，所以需要对目标细胞株进行长期稳定性观察，重点是细胞株超过可能的生产周期代次后的分子水平、生产状态、产量和产品质量的一致性，所以确认工程细胞的单克隆源性以及随时对其进行监控和鉴定对保证药物的产品质量具有重要的意义。

因此，本领域急需开发一种能快速进行扫描和鉴定待鉴定细胞单克隆源性的方法。

发明内容

鉴于现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种待鉴定细胞单克隆源性的分析方法。本发明所述待鉴定细胞单克隆源性的鉴定方法，直接从图像获得结果，检测过程直观方便验证，且检测速度快，通量高。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：