[发明专利]一种内源性糖皮质激素的检测方法及其应用

说明书

本发明属于分析化学技术领域，更具体的，本发明涉及一种内源性糖皮质激素的检测方法及其应用，所述内源性糖皮质激素的检测方法包括：尿液样本中几种内源性糖皮质激素的提取条件优化、质谱检测流程建立以及运动训练样本人群值分析。本发明提出的内源性糖皮质激素的检测方法所得到的LOD为0.1ng/mL，LOQ为1ng/mL，提取回收率大于87％，基质效应、精密度、准确度均在±15％以内。本发明提出的方法足以满足日常检测需求，同时在实际样本检测时能够实现高通量样本前处理，节省时间成本，减小人为操作误差，提高重现性和稳定性。

技术领域

本发明属于分析化学技术领域，更具体的，本发明涉及一种内源性糖皮质激素的检测方法及其应用。

背景技术

糖皮质激素(GC)是机体内极为重要的一类调节分子，它对机体的发育、生长、代谢以及免疫功能等起着重要调节作用，是机体应激反应最重要的调节激素，也是临床上使用最为广泛而有效的抗炎和免疫抑制剂。在紧急或危重情况下，糖皮质激素往往为首选。临床常见的糖皮质激素类药物有泼尼松、甲泼尼松、倍他米松、丙酸倍氯米松、泼尼松龙、氢化可的松、地塞米松等，具有抗毒、抗过敏、抗休克、非特异性抑制免疫及退热作用等多种作用，可以防止和阻止免疫性炎症反应和病理性免疫反应的发生，对任何类型的变态反应性疾病几乎都有效。几种常见的糖皮质激素类药物结构如下：

另外，临床研究表明，糖皮质激素类物质能够有不同程度的抗炎、损伤修复作用，能够增强运动耐力和爆发力，提升运动成绩，因此它被世界反兴奋剂机构(WADA)列为兴奋剂，禁止运动员使用。目前，各国实验室利用LC-MS、GC-MS、液相色谱、气相质谱等检测手段对尿液、唾液和血浆等基质进行定性定量分析。但是由于可的松和氢化可的松是内源性的，自然存在于人体当中，并且其浓度水平依赖于不同体质、年龄、种族以及运动项目等，在进行方法确认时无法实现统一的阈值建立。基于此，化学家们从其代谢产物角度出发，典型代表为泼尼松和泼尼松龙，由于代谢产物的浓度更依赖于母体浓度，且在短时间内不会出现太大波动，因此，可以通过对这两种物质的监控，保障运动竞技的公平公正。目前国际反兴奋剂机构的官方文件对于泼尼松和泼尼松龙的浓度要求是不超过60ng/ml，如果检测浓度在30-60ng/ml之间，此时需要使用同位素比质谱法对其来源进行进一步的明确，如果确认为自身产生的属于内源性来源，如果测定结果显示外部引入，那么就会定性为违反反兴奋剂规定，会产生一定的禁赛处罚。因其具有一定的调节运动极限能力以及疾病治疗功效，关于糖皮质激素的合成、检测以及进一步的应用研究受到广泛关注。然而，现有的糖皮质激素检测的灵敏度差，定量限高，不能适用不同种族、不同年龄、不同体质人群的检测。

发明内容

针对现有技术中存在的一些问题，本发明第一个方面提供了一种内源性糖皮质激素的检测方法，包括下面步骤：

(1)糖皮质激素的提取：取生物液于容器中，加入内标物、酸化试剂以及酶，于50-60℃酶解1-3h；酶解结束后加入碱液、醚类物质震荡、离心，离心结束后，取上清液，N₂吹干，加入提取液复溶，得到待检测液；

(2)对待检测液进行液相色谱、质谱检测，分析，即得。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述碱液选自碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾中一种或多种。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述碱液为碳酸氢钠和碳酸钠，碱液的pH为9-10。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述醚类物质的碳原子数为4-8。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述醚类物质和碱液的体积比为(70-90)：1。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述生物液和内标物的体积比为(8-12)：1。

作为本发明的一种优选的技术方案，所述提取液为水和乙腈。