[发明专利]一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法

说明书

本发明公开了一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，属于生物医学技术领域，包括以下步骤：S1分离原代钙化的VICs；S2配制条件诱导培养基；S3分离培养正常VICs；S4钙化诱导。本发明通过收集的钙化病人VICs原代细胞源性条件培养基，对人或大鼠原代VICs进行诱导，使其由VICs细胞转换为成骨样细胞。由此建立出一套能够反映临床CAVD病人病理进程的模型，为研究人员提供了更有利的条件，并且本发明稳定性好，易于保存，制备简单，更大程度的模仿临床病理模型，仿真性更强。

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及到一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法。

背景技术

钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)是涉及脂质沉积、慢性炎症调控及进展性钙化的病理过程，其特征为主动脉瓣小叶增厚、主动脉瓣环狭窄、左心室的机械应力增加引起严重并发症。CAVD是老年人群中最常见的心脏瓣膜疾病，5年内患者发生心力衰竭、主动脉瓣置换或死亡的风险非常高。CAVD诱因多样、发病机制复杂，分子和细胞过程尚未被清楚表征。

但近来主动脉瓣的主要细胞成分瓣膜间质细胞(valve interstitial cells,VICs)发生纤维性活化并向成骨细胞分化(即钙化)被认为是CAVD的关键环节。在正常的成人瓣膜中，VICs大部分处于静止状态，主要分泌适度的细胞外基质维持瓣膜稳态；而在CAVD病人的瓣膜中则鉴定出成纤维细胞样VICs及成骨细胞样VICs，主要介导钙盐沉积。且目前而言，在体诱导瓣膜钙化需要配合基因敲除鼠进行，方法繁琐且耗时久，而相比而言，细胞钙化模型变量易于控制且耗时较短，成为阐述CAVD的发病机制的新思路。因此，成功诱导VICs钙化模型是所有CAVD研究的基础，对从VICs层面探索CAVD的发病机制并寻求治疗靶点至关重要。

主动脉瓣钙化模型形成的基础理论为转录生长因子-β1(TGF-β1)介导的VICs活化和VICs发生表型转换成为成骨样细胞。现有技术中，最常见的VICs钙化模型的诱导方式为将VICs与成骨培养基共培养7～20天。成骨诱导培养基根据其所含有的主要成分分为以β-甘油磷酸为主成骨诱导培养基与以无机磷酸盐为主的成骨诱导培养基，或联合为混合含有β-甘油磷酸、地塞米松、抗坏血酸、氯化钙等成分的。尽管目前报道的几种钙化诱导培养基可以诱导VICs发生钙化，但其简化了每个因素对CAVD的影响，难以细致研究各因素之间的相互关系，以至于基于此得出的研究结论可能与真正的钙化途径不甚相关。

发明内容

本发明的目的是提供一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，可以根据所建立的瓣膜间质细胞钙化模型有效的研究临床上钙化性主动脉瓣疾病的特点、发病机制及治疗策略。

为达上述目的，本发明提供了一种仿真型瓣膜间质细胞钙化模型的建立方法，包括以下步骤：

S1制备原代钙化的VICs

获取临床钙化主动脉标本，通过酶消化法制备原代钙化的VICs；

S2配制条件诱导培养基

将S1所得原代钙化的VICs于5％CO₂，37℃条件下培养2-4d，收集上清液，用于配制条件诱导培养基；

S3分离培养

分离培养大鼠主动脉瓣原代VICs，或分离培养病人术后获取的正常主动脉瓣VICs原代细胞；

S4诱导

将步骤S3所得原代细胞加入步骤S2中的条件诱导培养基中，诱导2-8d，完成。

采用上述方案的有益效果是：获得活力较高的钙化的VICs、具备钙化诱导能力的条件培养基及被成功诱导钙化的仿真型瓣膜间质细胞钙化模型。

进一步地，步骤S1具体包括以下过程：