[发明专利]一种人类及哺乳动物细胞表达载体、表达系统及其构建方法和应用

说明书

本发明涉及一种人类及哺乳动物细胞表达载体、表达系统及其构建方法和应用。本发明通过在启动子的上游和PolyA的下游插入MAR 1‑68序列，同时，在MAR序列与启动子之间插入一段长度为500bp的间隔子DNA序列，构建获得MAR1‑68‑Spacer‑CMV‑目的基因‑PolyA‑MAR1‑68载体。该载体中Spacer片段为中性DNA序列，不能提高转基因表达水平，从而能够真正地探讨距离效应对转基因表达的影响。试验证明，包含上述表达载体的人类及哺乳动物细胞表达系统能够显著提高所携带的目的基因表达水平。因此，本发明提供的哺乳动物表达载体和表达系统能够克服转基因沉默，促进外源基因在宿主细胞中高水平稳定表达，可用于重组蛋白的生产。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种人类及哺乳动物细胞表达载体、表达系统及其构建方法和应用。

背景技术

目前，全球治疗性重组蛋白70％以上都是用人类及哺乳动物细胞表达系统生产的，表达载体是重组蛋白生产的重要的因素之一。当前人类及哺乳动物细胞表达系统中，一个亟需解决的问题就是转基因沉默现象(transgene silencing)。外源基因在宿主中表达受到抑制的现象称之为转基因沉默。转基因沉默的发生与转基因整合到宿主细胞基因中的位置有关，即表现出“位置效应(position effect)”。此外，转基因表达的强度受载体DNA序列的影响，例如，在细胞的扩大培养过程中，启动子的甲基化会导致表达的逐渐衰弱。适当地选用启动子，优化启动子和不同调控元件的组合，能提高重组蛋白的表达，阻止启动子的甲基化，增加表达的稳定性。因此，研究用于哺乳动物细胞表达系统高效稳定表达的载体，将极大地促进治疗性重组蛋白的研发和生产，具有重要的理论和实践意义。

当前，随着转基因技术的广泛应用，转基因沉默、基因表达水平低下或不能稳定表达已成为转基因动植物急需解决的关键问题。为了获得稳定表达的转基因株，人们在克服转基因沉默方面进行了许多有益的尝试，比如在构建表达载体时选用强启动子、使用增强子、在转基因操作时进行去甲基化处理等。而利用核基质附着区(matrix attachmentregion,MAR)来提高转基因表达是近年来发展起来的克服外源基因沉默的一种有效方法。

MAR是与核骨架(或核基质)特异结合的DNA序列，属于非编码序列，长度为300bp到几千bp，富含AT碱基对，位于基因两侧的非编码区。作为真核生物的一种新的顺式作用元件，目前关于MAR能提高外源基因表达水平，降低转基因沉默的报道已有很多。

前期的实验结果证实，MAR能提高转基因在稳定转染的中国仓鼠卵巢(Chinesehamster ovary，CHO)细胞的表达水平(Wang TY,Yang R,Qin C,et al.Enhancedexpression of transgene in CHO cells using matrix attachment region[J].CellBiol Int,2008,32:1279-1283.)，并且不同插入位点的MAR对转基因表达的影响不同，在MAR和启动子之间插入不同长度的EGFP，其对转基因表达的影响也不同(Zhang JH,WangXY,Wang TY,et al.Distance effect of matrix attachment regions on transgeneexpression in stably transfected Chinese hamster ovary cells[J].BiotechnolLett,2014,36(10):1937-1943.)。公布号CN103642838B公开了一种人类及哺乳动物细胞表达载体，该载体上仅插入人β-珠蛋白MAR序列(770bp)和EGFP(分别为350、750bp)，虽然能够介导外源基因在哺乳动物细胞中表达，但是仅用了其中一段MAR，并不是MAR序列的全长，并且外源片段来自EGFP，其序列本身对转基因表达的影响可能会引起某些干扰。目前，MAR在提高转基因表达水平方面尚不十分理想，与此同时，关于表达载体的位置、距离效应适配性的研究尚未报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可高效表达目的基因的人类及哺乳动物细胞表达载体。