[发明专利]基于密度梯度离心提取细胞内体的方法

说明书

本发明公开了基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，所述方法包括以下步骤：将含有内体的细胞膜破坏获取去核后上清液，将去核后上清液缓慢添加至蔗糖梯度溶液液面，然后进行离心，离心结束后从管底自溶液密度由高至低收集分离液即可获得含有内体的溶液，所述蔗糖梯度溶液为含有不同浓度梯度的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液的浓度范围为15％‑40.6％。本发明方法可以更快速获得更高纯度的内体，获得的内体可以用于研究经内体途径内吞的各类分子。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及基于密度梯度离心提取细胞内体的方法。

背景技术

外来物质在被细胞内吞后，大多数都会经过内体途径。内体为外来物质到达溶酶体降解之前的分选提供了环境。外来物质被内吞后首先形成内吞囊泡，有的囊泡初期会附有包被蛋白，而一旦内吞囊泡去包被，它们就会与早期的内体融合。早期的内体随后在与溶酶体融合之前成熟为晚期的内体。一些物质直接从早期的内体再循环到质膜，但大多数通过循环内体循环。

内体有三种不同类型：早期内体，晚期内体和循环内体。它们的区别在于胞吞材料到达其所需的时间和其上的标记蛋白Rab(一种小分子GTP酶)有所不同。它们也具有不同的形态。早期内体由动态的管状小泡网络组成(直径最大为1μm的小泡，连接的小管直径约为50nm)。标记物包括Rab5A和Rab4，转铁蛋白及其受体和EEA1。晚期内体，也称为MVB，主要是球形的，缺乏小管，并且包含许多密集的腔内囊泡。标记物包括Rab7，Rab9和甘露糖6-磷酸受体。循环内体主要集中在微管组织中心，由一个主要的管状网络组成，标记物为Rab1。

密度梯度离心可用于分离细胞内细胞器，在离心过程中，细胞器会漂浮或沉淀，直到它们到达梯度内的等密度位置。细胞器的密度取决于其内容物，大小，形状和脂质：蛋白质比例。密度梯度离心已经广泛应用于线粒体、溶酶体等细胞器的提取，但在内体提取、验证方面还没有完整可靠的实验方案。内体提取技术可以应用于研究各个不同内吞时期的物质的变化或用于富集快速内吞的部分物质。

在前人研究中，细胞膜破坏多用超声波破碎或电动匀浆方法，但超声破碎法产热明显，且这两种方法容易破坏细胞器结构和细胞内的大分子复合物，不利于内体结构完整性的保留和提取效果的验证。所以建立一种能保存内体完整性且操作简便的提取方法是很有必要的。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，用于解决现有技术中细胞内体提取困难的问题。

为了解决上述问题，本发明一方面提供了基于密度梯度离心提取细胞内体的方法，所述方法包括以下步骤：

将含有内体的细胞膜破坏获取去核后上清液，将去核后上清液缓慢添加至蔗糖梯度溶液液面，然后进行离心，离心结束后从管底自溶液密度由高至低收集分离液即可获得含有内体的溶液，所述蔗糖梯度溶液为含有不同浓度梯度的蔗糖溶液，所述蔗糖溶液的浓度范围为15％-40.6％。

进一步地，所述细胞膜破坏获取去核后上清液的方法选自以下任一：

a)将细胞计数离心后，添加缓冲液，转移进匀浆器中研磨，然后倒出研磨好的液体离心获得去核后上清；或

b)将细胞计数离心后，添加缓冲液，用注射器吸取液体，反复吹吸，然后将液体离心获得去核后上清。

进一步地，所述研磨次数为10-30次。

进一步地，所述注射器为1ml注射器，针头大小为23-27G，吹吸次数为15-20次。

进一步地，所述步骤a)或者步骤b)中离心条件为1600-2000g，8-12min，4℃。

进一步地，所述蔗糖浓度梯度溶液的浓度梯度为连续浓度梯度或者不连续浓度梯度。