[发明专利]一种农杆菌介导桃遗传转化方法

说明书

本发明涉及园艺作物基因工程领域，提供了一种农杆菌介导桃遗传转化方法，包括如下步骤：遗传转化受体建立，农杆菌的培养与侵染液的配置，侵染与共培养，除菌与筛选培养，抗性愈伤组织GUS染色鉴定。本发明以愈伤组织为受体，以GUS基因为报告基因，通过农杆菌GV3101介导的方法进行桃的遗传转化，获得抗性愈伤组织，历经数次继代，经GUS染色确定为阳性愈伤组织。本发明方法可以显著提升农杆菌介导转化的成功率，同时此方法可以在桃基因工程、细胞工程、代谢工程以及桃遗传转化体系的建立中得到广泛应用。

技术领域

本发明涉及园艺作物基因工程领域，尤其涉及一种农杆菌介导桃遗传转化方法。

背景技术

桃(Amygdalus persica L.)：蔷薇科、桃属植物，落叶小乔木。桃树原产于中国，早在公元前十世纪已有记载。桃主要栽植在中国、日本等亚洲国家。其种类包括黄桃、水蜜桃、油桃、蟠桃等。

桃的童期较长，采用传统的育种技术繁育需要花费较长的时间，这会大大增加劳动力成本，降低土地利用率。而利用基因工程进行种质改良，则可以解决这一问题，极大地缩短育种的时间。

分子生物学领域不断进步和发展，果树类园艺作物的遗传转化也在逐步完善。其中，桃的遗传转化起步相对较晚，直到1990年，R.SCORZA,P.H.MORGENS,J.M.CORDTS才用载体pGA472和根癌农杆菌A281获得了转基因愈伤组织。然而，此方法的转化效率较低，已不能满足当今需求。

据此，目前急需一种转化率更高的农杆菌介导桃遗传转化方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种转化率更高的农杆菌介导桃遗传转化方法。

本发明采用以下技术方案解决上述技术问题：

一种农杆菌介导桃遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)遗传转化受体建立

以桃当年新鲜下胚轴为外植体，接种在愈伤组织诱导培养基表面；诱导出的愈伤组织历经继代即可作为遗传转化受体；

(2)农杆菌的培养与侵染液的配置

将带有pSAK277-GUS质粒的农杆菌GV3101在LB固体培养基上划线活化，挑选单菌落进行菌液PCR；将挑选出的单菌落摇菌14～18h，涂布培养；在液体愈伤分化培养基中添加0.02～0.03％乙酰丁香酮后，再加入上述菌悬浮培养2～3h，即为侵染液；

(3)侵染与共培养

将步骤(1)得到的愈伤组织浸泡在步骤(2)配置的侵染液中，在25～30℃、50～80r/min的条件下侵染10～20min；取出后用无菌纱布过滤，并用滤纸吸干多余水分；最后，将其接种在共培养培养基上，暗培养2.5～3.5天；

(4)除菌与筛选培养

将愈伤组织从共培养培养基中取出，用含400～500mg/L羧苄青霉素Carb的无菌水进行清洗；反复清洗2～3遍后，用无菌纱布滤纸吸除水分，再转移到筛选培养基上培养；每20～30天进行一次筛选继代，存活下来的即为抗性愈伤组织；

(5)抗性愈伤组织GUS染色鉴定

将步骤(4)筛选获得的抗性愈伤组织分成两份，其中一份用于GUS染色检测，有特异性蓝色显色反应的愈伤组织即认定为阳性愈伤组织，表明桃遗传转化成功；另一份继续用筛选培养基继代，诱导不定芽。

作为本发明的优选方式之一，所述步骤(1)中，选择花芽分化时期的桃下胚轴为外植体。