[发明专利]一种细胞的膜受体蛋白鉴别方法以及验证方法

说明书

本发明适用于生物技术领域，提供一种细胞膜上受体蛋白的筛查方法以及验证方法，所述方法包括：在分离载体上修饰至少一种配体；用修饰后的分离载体与待筛查受体的细胞共同培养，得到表面结合有细胞的分离载体；基于机械力作用将细胞从所述分离载体上洗脱分离，弃去细胞并收集分离载体；将收集的分离载体经酶解处理得到肽段，并对肽段进行检测鉴别膜受体蛋白。本发明提供的细胞膜上受体蛋白的筛查方法，利用配体和受体间的高结合力，使用机械洗脱的方法直接从细胞表面拽取受体蛋白，从而实现细胞膜上受体的筛查，此方法简洁、高效、重现性好，有效解决了现有受体筛查技术在破碎细胞提取膜蛋白过程中所存在的容易丢失信息、背景蛋白干扰严重等问题。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种细胞的膜受体蛋白鉴别方法以及验证方法。

背景技术

膜蛋白的分析由于它们的疏水性、复杂的翻译后修饰（PTM）以及低丰度，一直以来都是蛋白研究的难点。常用的鉴定膜蛋白受体的方法包括：提取细胞总蛋白或膜蛋白，进行亲和层析pull-down或免疫共沉淀钓取受体蛋白进行鉴定；另外也可使用酵母双杂交、膜蛋白芯片、膜蛋白RNA-sequence分析、2-D电泳等方法，利用蛋白互作鉴定候选受体。

然而，总蛋白或膜蛋白提取过程常需要使用去垢剂，存在蛋白构象改变、提取效率低（一般需要2~3种去垢剂配方才可提取70-90%膜蛋白，信号损失大）、背景干扰严重（非膜蛋白、共结合蛋白和背景高丰度蛋白等）、后续排除鉴定工作量大等缺陷。而酵母双杂交鉴定到的是相互作用蛋白，不一定为受体，假阳性率高，工作量繁重；膜蛋白芯片和膜蛋白RNA-sequence分析等技术壁垒高，费用高。

可见，现有的膜受体蛋白鉴别方法还存在着蛋白构象改变、效率低、假阳性率高、工作量大、背景干扰严重等技术问题，导致膜受体蛋白鉴别效果不够理想。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种细胞的膜受体蛋白鉴别方法，旨在解决现有的膜受体蛋白鉴别方法还存在的蛋白构象改变、效率低、假阳性率高、工作量大、背景干扰严重，导致膜受体蛋白鉴别效果不够理想的技术问题。

本发明实施例是这样实现的，一种细胞的膜受体蛋白鉴别方法，包括：

在分离载体上修饰至少一种配体；所述分离载体是凝胶或者磁珠；

用修饰后的分离载体与待筛查受体的细胞共同培养，得到表面结合有细胞的分离载体；

基于机械力作用将细胞从所述分离载体上洗脱并收集分离载体；

将所述收集的分离载体直接酶解处理得到肽段，并对所述肽段进行检测鉴别膜受体蛋白。

本发明实施例的另一目的在于提供一种细胞的膜受体蛋白验证方法，在通过如上述所述的细胞的膜受体蛋白鉴别方法确定膜受体蛋白后，还包括：

利用抗体封闭、RNAi干扰、KI、KO中的一种或多种方式验证膜受体蛋白。

本发明实施例提供的一种通过在凝胶或者磁珠上修饰至少一种配体蛋白，利用受体-配体间的相互作用力使分离载体与细胞的膜受体蛋白相结合，然后使用机械力将细胞从凝胶或者磁珠上洗脱，即直接从细胞膜表面拽取膜蛋白受体，然后对凝胶或磁珠表面的蛋白直接酶解得到肽段，通过进一步对肽段进行检测，配合蛋白质数据库从而完成膜受体蛋白的鉴别。本发明提供的细胞的膜受体蛋白鉴别方法，简便易操作，费用低，并且不需要裂解细胞提取膜蛋白，有效解决了现有技术在提取蛋白过程中所存在的容易丢失信息，背景蛋白干扰严重的问题，因此信息丢失少，背景干扰少，命中率高，同时显著减少了后续生物学或分子对接的验证工作量。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种细胞的膜受体蛋白鉴别方法的流程图；

图2为本发明实施例提供的一种分离载体与待识别膜受体蛋白的细胞结合的示意图；