[发明专利]一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组、试剂盒及方法

权利要求书

1.一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的引物组，稻瘟病菌无毒基因AvrPi9发生SNP变化导致AvrPi9基因编码提前终止、转变为有毒基因，所述引物组包括两对引物，第一对引物为：上游引物AvrPi9W1和下游引物AvrPi9W2，

AvrPi9W1序列：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’，

AvrPi9W2序列：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’；

第二对引物为：上游引物AvrPi9N1和下游引物AvrPi9N2，

AvrPi9N1序列：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’，

AvrPi9N2序列：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’。

2.如权利要求1所述引物组在检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异中的应用。

3.一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物组。

4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，还包括PCR扩增所用的DNA聚合酶以及缓冲液。

5.一种检测稻瘟病菌无毒基因AvrPi9致病性变异的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)收集水稻中稻瘟病菌发病部位，并分离稻瘟病菌作为检测样本；

(2)提取步骤(1)检测样本中基因组DNA；

(3)以步骤(2)提取的基因组DNA作为模板，使用第一对引物PCR扩增出AvrPi9基因片段，再以扩增出的AvrPi9基因片段为模板，使用第二对引物进行PCR扩增，

第一对引物为：上游引物AvrPi9W1和下游引物AvrPi9W2，

AvrPi9W1序列：5’-CAGGATTCCAGCTATTCGACAAC-3’，

AvrPi9W2序列：5’-CACTCGCATTATCGCATAATTGC-3’；

第二对引物为：上游引物AvrPi9N1和下游引物AvrPi9N2，

AvrPi9N1序列：5’-GCTGACGTCTTTGATAGCTGGTACC-3’，

AvrPi9N2序列：5’-TCTACCAGTGCGTCTTTTCGACCTA-3’；

(4)检测步骤(3)扩增产物，如果第二对引物扩增出214bp片段，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9出现致病性变异，否者待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9没有致病性变异。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)中同时将第一对引物和第二对引物加入反应体系中进行PCR扩增。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，检测体系为20μL，包括10μL 2×PCR mix、0.5μL 100ng/μL的DNA模板、10μM引物AvrPi9W1/W2各1μL、10μM引物AvrPi9N1/N2各0.2μL，余量为ddH₂O。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性30sec，62℃退火30sec，72℃延伸30sec，扩增35个循环；最后72℃延伸5min。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，PCR扩增产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测结果有674bp和214bp两条条带，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9出现致病性变异；检测结果只有一条674bp的条带，则待检测的稻瘟病菌无毒基因AvrPi9没有致病性变异。