[发明专利]一株耐高浓度甲醇、高产丁醇食甲基丁酸杆菌及其制备方法

说明书

本发明公开了一株耐高浓度甲醇、高产丁醇食甲基丁酸杆菌及其制备方法，所述菌株由食甲基丁酸杆菌Butyribacterium methylotrophicum（编号ATCC 33266）经过实验室适应性进化筛选得到食甲基丁酸杆菌突变菌株Butyribacterium methylotrophicum MT750，保藏编号为CCTCC NO：M 2020095，再将产丁醇基因导入该突变株获得。与出发菌株相比，经过实验室适应性进化筛选的食甲基丁酸杆菌可以耐受浓度700mM以上的甲醇，将含有产丁醇基因的穿梭质粒pJIR‑Pptb‑adhE2经甲基化后转化进入食甲基丁酸杆菌菌体内，使其可以利用甲醇生产丁醇，具有巨大的应用潜力。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一株耐高浓度甲醇、高产丁醇食甲基丁酸杆菌及其制备方法。

背景技术

实验室适应性进化(ALE)已被用作一种有效的方法，提高菌体耐受甲醇的能力和提高丁酸的产量。限制修饰系统是广泛存在于细菌，主要由限制内切酶和甲基化酶组成的二元系统，限制酶功能是降解外源DNA，从而阻止其复制和整合到宿主细胞中，修饰酶作用是对自身某个碱基进行甲基化，保护自身DNA不被降解。

非模式菌株食甲基丁酸杆菌，简称Bm，是一种厌氧芽孢梭菌属，属于单碳厌氧型，可以同时利用多种C1原料进行发酵，如CO₂、CO和甲醇等。另外，还能代谢多碳物质，包括葡萄糖、乳糖和丙酮酸，对这些物质代谢的主要产物是醋酸、丁酸或二者皆有，以及相应的醇类。Bm可用于生产石油和化学物质，开发食甲基丁酸杆菌作为甲醇利用的模式宿主，对促进甲醇生物转化具有重要意义。然而当前研究中该菌株遗传操作工具的缺乏，限制了其发展和应用。

提高食甲基丁酸杆菌对于甲醇的耐受性有利于提高菌体对于甲醇的利用和丁酸的合成，提高其在实际应用中的价值。目前对于食甲基丁酸杆菌遗传操作工具很少，需要建立一套甲基化工具，便于进行后续基因操作。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一株耐高浓度甲醇、高产丁醇食甲基丁酸杆菌，其特征在于，由食甲基丁酸杆菌经过实验室适应性进化筛选得到食甲基丁酸杆菌突变菌株，再将产丁醇基因导入突变株获得所述耐高浓度甲醇、高产丁醇食甲基丁酸杆菌Butyribacterium methylotrophicum MT751，其中所述食甲基丁酸杆菌突变菌株分类命名为Butyribacterium methylotrophicum MT750，其保藏编号为 CCTCC NO：M 2020095。

所述食甲基丁酸杆菌为Butyribacterium methylotrophicum，来源于美国典型菌种保藏中心，编号为ATCC 33266。

本发明的第二目的在于提供上述耐高浓度甲醇、高产丁醇食甲基丁酸杆菌的制备方法，包括如下步骤：

(1)以食甲基丁酸杆菌作为出发菌株，采用实验室适应性进化逐步提高培养基中甲醇浓度筛选具有高甲醇耐受性的食甲基丁酸杆菌突变菌株；

(2)制备E.coli top10感受态；

(3)将含有甲基化酶基因的质粒转化进入E.coli top10；

(4)将步骤(3)获得的E.coli top10制备成感受态；

(5)构建含有产丁醇基因的穿梭质粒，并将其转化进步骤(4)得到的E.coli top10感受态细胞；

(6)从步骤(5)制备的E.coli top10中提取质粒；

(7)制备食甲基丁酸杆菌突变菌株感受态；