[发明专利]一种利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法

权利要求书

1.一种利用磁性纳米粒子固定化细胞酶解鱿鱼内脏制备ACE抑制肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、原料的预处理：鱿鱼内脏与去离子水混合加热，去除块状鱼骨，绞碎、干燥、粉碎，获得鱿鱼内脏提取物细粉；

B、磁性纳米微球的制备：Fe₃O₄纳米微粒与乙醇混合，分散；之后加入脱气去离子水、氨水和硅酸四乙酯反应，用外加磁场分离，清洗、干燥，获得二氧化硅包裹的Fe₃O₄纳米微球，即Fe₃O₄@SiO₂；所述 Fe₃O₄@SiO₂与脱气超纯水混合、分散，之后缓慢加入PEI，搅拌反应，用外加磁场分离，清洗、干燥，获得PEI修饰的Fe₃O₄@SiO₂纳米微球，即PEI-Fe₃O₄@SiO₂纳米微球；

C、菌株活化与培养：取芽孢杆菌进行摇床活化与培养，离心收集细胞，洗涤后获得菌体细胞；

D、细胞的磁性纳米颗粒固定化：所述PEI-Fe₃O₄@SiO₂纳米微球溶于磷酸缓冲液中配制成悬液，分散加入所述菌体细胞，在摇床中吸附，利用外加磁场分离，清洗后获得固定化细胞；

E、鱿鱼内脏蛋白的酶解：所述鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水，获得底物溶液，再加入所述固定化细胞进行酶解，酶解反应完后，用外加磁场分离所述固定化细胞，上清液进行灭酶处理，获得酶解上清液；

F、鱿鱼内脏酶解肽的分离提取：酶解上清液经过离心，去除未被酶解的成分，离心后上清液过滤，滤液经浓缩、冷冻干燥，获得鱿鱼内脏活性肽粉；

具体包括如下步骤：

A、原料的预处理：所述鱿鱼内脏与所述去离子水按1g：1~2ml的比例混合，于90~100℃加热20~30min后，去除块状鱼骨，之后在破碎匀浆机中绞碎，然后置于浅盘中在80~90℃条件下干燥18~20小时，收集干燥后的块状粉末，于粉碎机中磨成细粉，过60~80目筛，获得所述鱿鱼内脏提取物细粉；

B、磁性纳米微球的制备：所述Fe₃O₄纳米微粒与所述乙醇按1g：200~300mL混合，超声波分散1~2小时；之后按体积比30~35:15~20:1~2加入所述脱气去离子水、所述氨水和所述硅酸四乙酯，所述Fe₃O₄纳米微粒与所述脱气去离子水的比例为1g：30~35ml，在40~45℃条件下搅拌反应8~10小时，用外加磁场分离，去离子水和乙醇交替清洗纳米颗粒3~5次，室温条件下在真空干燥，获得所述Fe₃O₄@SiO₂；所述 Fe₃O₄@SiO₂与所述超纯水按1g：200~300mL混合，超声分散1~2小时，之后缓慢加入所述PEI ，所述 Fe₃O₄@SiO₂与所述PEI的质量比为1:0.2 ~0.4，于30~35℃搅拌下反应6~10小时，用外加磁场分离，用去离子水清洗至pH中性，再次悬浮于去离子水中，超声分散后，于室温条件下在真空干燥，获得所述PEI-Fe₃O₄@SiO₂纳米微球；

C、菌株活化与培养：取所述芽孢杆菌采用1%接种量接种于培养基，于37~40℃、200~250r/min摇床活化24~30小时；活化后的培养物按2%的接种量接种于培养基中，于37~40℃、120~150 r/min摇床培养16~24小时，在转速8000 ~9000rpm、温度3~4℃离心收集细胞，用无菌生理盐水洗涤2~3次后备用，获得所述菌体细胞；

D、细胞的磁性纳米颗粒固定化：称取所述PEI-Fe₃O₄@SiO₂纳米微球溶于20 ~25mMpH7.5 的磷酸缓冲液中配制成 0.2 ~0.3g/L的悬液，于30~35℃水浴中超声波分散5~10min；按细胞湿重与所述PEI-Fe₃O₄@SiO₂纳米微球比例为0.5~2 mg/mg，加入所述菌体细胞，在25~30℃摇床中120~150 r/min 吸附1~2小时；利用外加磁场分离，用灭菌的培养基清洗2~3遍，获得所述固定化细胞，于3~4℃保存待用；

E、鱿鱼内脏蛋白的酶解：所述鱿鱼内脏提取物细粉溶于蒸馏水配制成10~20g/L水溶液，调节pH 至8.0~9.0，获得酶解液；按1L 酶解液中加入1~5 g 所述固定化细胞，于40~50℃，120~150rpm搅拌条件下，酶解6~8小时，酶解过程中维持pH 在8.0~9.0；酶解反应完后，用外加磁场分离所述固定化细胞，上清液于80~95℃条件下灭酶处理15~20min，获得酶解上清液；

F、鱿鱼内脏酶解肽的分离提取：所述酶解上清液经5000~5500rpm 离心，去除未被酶解的成分，离心后上清液用截留分子量为1 kDa的超滤膜过滤，滤液经低温减压浓缩后，冷冻干燥，获得所述鱿鱼内脏活性肽粉；

所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌CMCC63501。