[发明专利]病毒性脑膜炎辅助诊断分子标记物及其应用和试剂盒

说明书

本发明公开了一种病毒性脑膜炎辅助临床诊断分子标记物及其应用和试剂盒。首先采用miSeq高通量测序技术对病毒性脑膜炎和正常对照两大组脑脊液样本进行系统基因芯片分析，筛选差异miRNA表达，进而采用RT‑qPCR技术对筛选出的差异表达miRNA逐个验证，最终发现，miR‑RNA 18_41385，hsa‑miR‑486‑5p，hsa‑miR‑4497和hsa‑miR‑3178可作为病毒性脑膜炎早期辅助临床诊断的特异性标记物。这些标记物还能对其它脑膜炎进行鉴别诊断。本发明试剂盒具有稳定性好，检测方法简便、敏感性高和具有特异性等优点，实现了对临床现有病毒性脑膜炎诊断方法的有效补充和对病毒性脑膜炎患者的快速确诊，对降低病毒性脑膜炎的死亡率、改善治疗效果及预后具有重要意义。

技术领域

本发明属于病毒性脑膜炎诊断技术领域，具体涉及病毒性脑膜炎诊断的脑脊液特异性分子标记物，及其应用和配套的检测试剂盒。

背景技术

在我国乃至全世界，病毒性脑膜炎是比较常见而严重的中枢神经系统感染性疾病，可由各种病毒侵犯脑膜所致。病毒性脑膜炎可引起发热、头痛、呕吐，严重时可造成永久性脑损伤，甚至死亡。与其它类型中枢神经系统感染的临床表现极为相似，需要结合病史、脑脊液检查及病原学分析进行鉴别；同时一些非病毒感染性疾病如化脓性脑膜炎、真菌性脑膜炎、结核性脑膜炎等所表现出的症状也与病毒性脑膜炎相似，所以临床上经常导致很多病毒性脑膜炎患者早期误诊误治，错过早期的最佳抗病毒治疗时间，到后期又难以治愈，很多病人由于没有得到及时而有效的治疗,造成死亡或者留下严重的后遗症。目前，病毒性脑膜炎早期的脑脊液及影像学检查也缺乏特异性，极易误诊。如果可以在早期对患者进行有效的抗病毒治疗，大部分患者将效果良好，而若延误治疗则致残率、致死率很高。因此，早期能快速、准确地从脑膜炎患者脑脊液等临床标本中检测出病毒性脑膜炎的感染特征性标记分子和核酸，对病毒性脑膜炎的早期诊断和治疗、预后具有重要的临床指导意义和市场开发价值。

目前关于病毒性脑膜炎的确诊，大多数医院临床检验师、临床医师、研究者主要还是在影像学证据的基础上依靠临床表现和实验室检查结果等来进行综合经验判断。

(1)苏木精—伊红染色法(简称HE染色)，苏木精染液为碱性,主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料,主要使细胞质和细胞外基质中的成分着红色，可观察到细胞的一般形态结特点。虽然HE染色广泛应用在病毒性脑膜炎的辅助诊断，但其诊断特异性较差，准确率与检查者的技术与经验直接有关，具有一定的不确定性。

(2)脑脊液或脑组织病原检测是确诊病毒性脑膜炎的金标准。然而，脑膜炎过程常局限在颞叶的中央和深层，如果取材不到位即达不到目的，而且病毒种类较多，新发或不明原因病毒性脑膜炎的增多，病毒分离常规开展很困难，且缺乏特异、敏感的分子生物学检测方法。①用脑组织作病毒分离是目前公认的最可靠确诊手段，但不能作为常规诊断手段，首先是诊断时间，部分病毒(如单纯疱疹病毒)可短时间内即可从神经组织中消失，其次活检还可能对大脑造成伤害，偶尔引起大出血或并发感染。②目前应用最多的是脑脊液中多种病毒特异性抗体(IgG、IgA、IgM)检测，在病毒性脑膜炎诊断中其阳性率为88.9％，而在病毒性脑膜炎早期诊断中其阳性率仅为32.5％。③PCR技术检测脑脊液中病毒基因是新兴的分子基因检测技术，检测方法快速、便捷，但是脑脊液CSF中病毒或其抗原含量微量，导致检测阳性率极低，容易出现假阳性，且依赖于基因组测序平台。④免疫学和血清学方法也具有一定的局限性，同时受实验室条件所限尚未普遍开展，确诊往往无特异性。

(3)CT、MRI等影像学技术在病毒性脑膜炎早期诊断检查，其阳性率极低，一般早期很难发现病灶或无异常表现，病毒性脑膜炎的脑电图波型主要为弥漫性不规则高波幅慢波,对局灶性病变,脑电图常表现为一侧较重,可协助判断病变部位，病毒性脑膜炎患者脑功能异常早于结构异常，而且病灶边缘的清晰度不一，容易造成与其他疾病的混淆，而且在发病的初期，其影像学特异性表现并不明显，CT、MRI等影像学技术对于病毒性脑膜炎的诊断的准确率主要是在发病的中、晚期，且其检查价格高昂，不适合作为大众人群的常规筛查手段。