[发明专利]野菊U6基因及其应用

说明书

本发明提供了一种野菊U6基因及其应用。本发明首次从野菊中克隆了U6基因全长序列，并设计了该基因用于实时定量PCR的引物。该基因与与拟南芥、玉米、番茄中的U6基因高度同源，且该基因在野菊不同组织及UVB处理条件下表达量稳定，可靠性强。本发明证实野菊U6基因及其引物可以用于野菊miRNA的相对定量表达分析，具有操作简单、准确性高及稳定性好的特点，为野菊miRNA定量表达分析提供了新的方法。

技术领域

本发明属于植物分子生物学技术领域，尤其涉及野菊U6基因及其应用。

背景技术

miRNA(MicroRNA)是一种广泛的内源性小RNA，长度在20至24个核苷酸之间，通过翻译抑制和或与mRNA靶标结合使靶基因降解，被证明是转录后关键的基因调控因子。miRNAs在植物整个生长发育、逆境应答及激素调节等过程中都发挥着重要的作用，因其在生物中的重要性，miRNAs的挖掘、表达及功能研究成为全世界科学家争相研究的热点。从2002年第1种植物miRNA的发现到目前为止，已有38589条miRNA被登录到miRBase22.1数据库中。

野菊(Chrysanthemum indicum L.)是菊科菊属多年生草本植物，分布范围广，野生于山坡草地、田间、路旁等处，耐瘠薄，适应性较强。最重要的是它具药用价值，叶、花及全草都可以入药。在对野菊miRNA进行研究时，如何选择一个表达稳定的基因作为内参进行数据标准化成为本领域面临的问题。

目前对miRNA的表达分析的研究方法主要有三种，即高通量测序，基因芯片和实时荧光定量PCR。由于高通量测序和基因芯片法均为高通量监测的方法，成本高，不适于少量miRNA的表达分析。而利用SYBR Green染料荧光定量PCR的方式进行miRNA相对定量法表达分析就有着操作相对简单，成本较低，灵敏度高的优势。逐渐成为科研人员常用的miRNA时空表达特异性分析常用的方法。在相对定量中，内参的选择尤为重要。目前内参的选择大多数采用一些表达相对稳定的管家基因，比如传统的β-action。但由于miRNA碱基长度的特殊性，无法用之前研究过的稳定内参。因此，有必要开发新的用于miRNA定量表达分析的内参基因。

U基因编码的一种细胞核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)，其长度一般为100-215bp，由于其编码的碱基序列富含U，故名为U基因。其中U6是由RNA聚合酶Ⅲ催化转录的，而其他snRNA均由RNA聚合酶Ⅱ催化转录而来，且U6在植物不同组织中表达量稳定、含量丰富，且不受环境影响而变化，逐渐成为研究miRNA表达的内参基因。

但是菊花U6基因序列和引物尚未有相关报道，更没有以野菊U6基因作为内参来对野菊中的miRNA进行定量分析的相关研究。

发明内容

本发明针对现有研究的不足，在野菊中克隆到U6基因全长序列，并初步确定该基因可作为野菊miRNA定量PCR检测的内参基因。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：本发明野菊U6基因的核心序列为：

ATCATTGTCCCTTCGGGGACATCCGATAAAATTGGAACGATACAGAGAAGATTAGCATGGCCCCTGCGCAAGGATGACACGCACAAATCGAGAAATGGTCCAAATTTTTTT(SEQ ID NO.1)

基于野菊U6核心序列进行引物设计，获得的实时荧光定量PCR的引物序列如下：

FP:CGATAAAATTGGAACGATACAGA(SEQ ID NO.2)

RP:ATTTGGACCATTTCTCGATTTG(SEQ ID NO.3)

本发明通过对野菊根、茎、叶、花中的U6基因进行扩增发现该引物熔解曲线均出现单峰，特异性良好且无引物二聚体出现。扩增曲线表明在野菊各组织中U6基因的CT值均为18左右，稳定性较好。