[发明专利]核酸分子、载体和细胞及其应用及基于父系印记基因的植物无融合生殖克隆种子的筛选方法

权利要求书

1.一种核酸分子，其特征在于，该核酸分子包含基于印记基因的表达盒E1，所述表达盒E1自上游至下游包括父系印记基因功能区、第一启动子、筛选标记基因和第一终止子；

优选的，所述父系印记基因功能区包括ICR、DMR2′和DMR1的融合序列，所述融合序列优选如SEQ ID NO.2所示；和/或

所述第一启动子为胚特异表达启动子，优选选自OsESP1、Ole18、OsVP1P和ZmESP，更优选为OsESP1启动子，其序列优选如SEQ ID NO.3所示；和/或

所述筛选标记基因为荧光蛋白编码基因，优选为红色荧光蛋白编码基因，更优选为红色荧光蛋白基因DsRed2，所述DsRed2的序列优选如SEQ ID NO.4所示；和/或

所述第一终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；

优选的，所述基于印记基因的表达盒E1包括如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中，该核酸分子还包含表达盒E2，所述表达盒E2携带有胚自主发生基因；

优选的，所述表达盒E2自上游至下游包括：第二启动子、胚自主发生基因和第二终止子；

优选的，所述第二启动子为卵细胞特异启动子，优选选自AtDD45、Os03g0296600pro、ECA1-like1 pro、DCL2、AT1G74480.1和ZmEAlpromoter；更优选为AtDD45，AtDD45的序列优选如SEQ ID NO.7所示；和/或

所述胚自主发生基因选自BBM1、WUS、LEC、CLAVATA和MYB115，优选为BBM1，BBM1的序列优选如SEQ ID NO.8所示；和/或

所述第二终止子为Nos终止子，所述Nos终止子的序列优选如SEQ ID NO.5所示；

优选的，所述表达盒E2包括如SEQ ID NO.6所示的核苷酸序列。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其中，该核酸分子还包含表达盒E3，所述表达盒E3携带有产生MiMe突变体的元件，以促使有丝分裂替代减数分裂；

优选的，MiMe突变体中包括PAIR1、REC8和OSD1的突变，产生MiMe突变体的元件包括：如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示的构建PAIR1突变的靶标序列，如SEQ ID NO.11和SEQ IDNO.12所示的构建REC8突变的靶标序列，如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示的构建OSD1突变的靶标序列。

4.一种重组载体，其特征在于，该重组载体包括权利要求1-3中任意一项所述的核酸分子；

优选的，所述重组载体包括权利要求2所述的核酸分子，且所述表达盒E1和所述表达盒E2以连锁表达盒的形式插入在所述重组载体中。

5.根据权利4所述的重组载体，其中，所述重组载体包括含有所述连锁表达盒和表达盒E3的核酸分子；

优选的，所述重组载体通过对载体进行MiMe突变，并插入所述连锁表达盒获得。

6.一种转基因细胞，其特征在于，该转基因细胞含有权利要求1-3中任意一项所述的核酸分子，或者权利要求4或5所述的重组载体。

7.权利要求1-3中任意一项所述的核酸分子，或者权利要求4或5所述的重组载体，或者权利要求6所述的转基因细胞的应用，其中，所述应用包括如下(a1)-(a4)中的至少一种：

(a1)孤雌生殖克隆种子的筛选；

(a2)制备无融合生殖系；

(a3)一系法育种；

(a4)固定植物杂种优势。