[发明专利]鸭4型腺病毒实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒

说明书

本发明涉及一种鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV‑4)实时荧光定量PCR检测引物和探针，具体序列分别见SEQ ID NO.1‑3。本发明包括特异性引物和探针序列的设计、标准质粒的构建、实时荧光定量PCR扩增方法的建立和优化、结果检测判定。本发明建立的检测DAdV‑4的实时荧光定量PCR的方法，在检测DAdV‑4上灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测33.52个拷贝/μL，可用于检测临床样本中DAdV‑4的致病机理研究和开展疫病流行病学调查。

技术领域

本发明涉及一种鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)实时荧光定量PCR检测引物、探针及试剂盒，属于鸭病学领域。

背景技术

鸭4型腺病毒(duck adenovirus 4，DAdV-4)是2019年在我国南方地区发现一种鸭新型腺病毒病。对该病毒基因组进行分析发现，其主要基因编码蛋白均和鸭群中前期发现的鸭1型腺病毒、鸭2型腺病毒和鸭3型腺病毒相关基因的核苷酸和氨基酸同源性均低于80％。遗传进化分析表明，DAdV-4属于腺病毒科(Adenoviridae)禽腺病毒属(Aviadenovirus)，但处于一个独立的遗传进化分支，将其命名为鸭4型腺病毒(duckadenovirus 4，DAdV-4)。2020年，本研究团队在福建地区鸭群中也证实存在鸭4型腺病毒(DAdV-4)感染(命名为DAdV-4-FJ001株，GenBank登录号MW238795)，测定的DBP基因和鸭4型腺病毒参考株GD-2019株(GenBank登录号MN733730)核苷酸同源性为100％。

目前，在对新鉴定的传染病病原的检测方法主要是基于核酸水平的检测，如PCR方法和实时荧光定量PCR方法(real time PCR)。实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参(或外参)对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。荧光探针法是用序列特异的荧光标记探针来检测产物，探针法的出现使得定量PCR技术的特异性比常规PCR技术大大提高。目前较常提及的有TaqMan探针、FRET杂交探针(荧光共振能量传递探针)和分子信标(molecular Beacon)。TaqMan探针法是指PCR扩增时在加入一对引物的同时另外加入一个特异性的荧光探针，该探针只与模板特异性地结合，其结合位点在两条引物之间。探针的5′端标记有荧光报告基团(Reporter,R)，如FAM、VIC、JOE等，3′端标记有荧光淬灭基团(Quencher,Q)，如Eclipse、TAMRA等。当探针完整的时候，5′端报告基团经仪器光源激发的荧光正好被近距离的3′端荧光基团淬灭，仪器检测不到5′端报告基团所激发的荧光信号(就是说5’荧光基团的发射波长正好是3’荧光基团的吸收波长，因而能量被吸收传递到3’荧光基团而发出其它荧光)。随着PCR的进行，Taq酶在链延伸过程中遇到与模板结合的探针，其5′-3′外切酶活性(此活性是双链特异性的，游离的单链探针不受影响)就会切割探针，释放5′端报告基团游离于反应体系中，远离3′端荧光淬灭基团的屏蔽，5′端报告基团受激发所发射的荧光信号就可以被探头检测到。也就是说每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步，报告信号的强度就代表了模板DNA的拷贝数。

当前国内外尚未见实时荧光定量PCR检测DAdV-4的引物、探针及其方法相关研究报道，本发明的建立可填补国内外相关领域空白。

发明内容

本发明的目的是为了填补现有尚未见实时荧光定量PCR检测DAdV-4的方法相关研究报道空白，提供一种DAdV-4实时荧光定量PCR检测引物和探针及其应用。该方法灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，最低可检测33.52个拷贝/μL，可用于对临床样本中DAdV-4的分子流行病学调查，为明确DAdV-4的分子流行病学特点提供检测方法和手段。

本发明的目的通过如下技术方案实现：