[发明专利]一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷传感器

说明书

本发明公开了一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷传感器的制备方法，以羧基荧光素(FAM)为能量供体，金纳米粒子(AuNPs)为能量受体。分别使用ATP适体以及与ATP适体碱基互补的单链DNA分别标记AuNPs与FAM。将上述两段标记好的单链DNA相互杂交后，得到荧光ATP适配体传感器。检测时，ATP会打开传感器杂交结构，迫使ATP适体3’和5’端互相杂交，形成茎环结构，FAM的荧光恢复。加入Exo III酶会促使ATP适体水解，ATP释放出来重新进入检测循环，体系的荧光继续增强直至检测体系内所有的荧光传感器被消耗完毕。由于ATP靶标的循环使用，导致本传感器具有较低的检测限和较高的灵敏度。

技术领域

本发明涉及生物传感器技术领域的制备方法，具体涉及一种基于核酸适体与酶促靶标循环的荧光三磷酸腺苷(ATP)传感器及其制备方法，并将其用于对ATP的检测。

背景技术

核酸适体是一类拥有特定碱基序列的寡核苷酸分子，近年来研究发现，寡核苷酸不仅具有遗传信息的储存和传递功能，还可以通过空间折叠形成三维结构并与不同类型的靶标(例如：小分子、病毒和细菌等)形成特异性杂交，这意味着非寡核苷酸(例如蛋白)也可以寻找到具有特定碱基序列的寡核苷酸并与之进行特异性结合，并能达到很高结合力，甚至会高于抗体与抗原的结合力。此时，这种特定碱基序列的寡核苷酸被称之为“适体”，而靶标称之为“配体”。目前发现，金属离子、小分子、氨基酸、辅酶、多肽、蛋白质、病毒和细菌等各种靶标都可以寻找到高结合力的适体。因此，可以将核酸适体作为敏感单元开发各种生物传感器。参与生命过程的小分子三磷酸腺苷(ATP)在细胞中的浓度与癌症等疾病密切相关，ATP是活细胞中的通用能源，在细胞生理中调节细胞代谢和生化途径中起着至关重要的作用。ATP水平可用于评估各种小分子药物和生物制剂诱导的细胞损伤，抑制和增殖，异常的ATP水平已与特定疾病(如心血管疾病)相关，因此，它已被广泛用作活生物体中细胞活力和细胞损伤的指示剂。因此，ATP的检测在疾病诊断及分子生物学的功能分析方面都具有十分重要的意义。

虽然基于核酸适体的电化学、表面拉曼增强等信号增强手段的生物活性小分子适配体传感器已经达到极低的检测限(pM～nM)，但若要进行细胞成像等原位观察，还需使用基于荧光信号的生物传感器。以荧光ATP适配体传感器为例，目前已报到的传感器检测限一般处于nM～μM，远高于荧光DNA生物传感器的检测限，这是由于一条ATP适体能够与两分子ATP结合，且ATP与其适体的解离常数在μM级别，从而在总体上限制了传感器的灵敏度。

发明内容

(一)要解决的技术问题

本发明所要解决的技术问题是克服现有ATP荧光生物传感器检测限较低，一般＞10nM左右的问题。

(二)技术方案