[发明专利]对中药制剂进行预处理的方法

权利要求书

1.对中药制剂进行预处理的方法，所述方法包括如下步骤：在符合无菌检测的工作环境和工作条件下，将10重量份口服固体中药制剂、1.25重量份甘氨酸和0.5重量份氯化钾混合，接着将其研碎成均匀混合的细粉，得到中药预处理粉；其中，

所述甘氨酸和氯化钾是预先经历无菌处理的；

所述中药制剂选自：健胃消食片、金果含片、女金胶囊、金水宝胶囊、乌鸡白凤丸、大活络丸、四逆散中的一种；

该方法所获得的中药预处理粉用于测定其中的沙门氏菌并据此测定结果评价所述中药制剂被沙门氏菌污染的状况；

测定中药预处理粉中的沙门氏菌是使用实时荧光PCR法进行检测的，实时荧光PCR法检测沙门氏菌包括如下操作步骤：

步骤一、提供引物和探针

沙门氏菌实时荧光PCR法检测用的引物和探针的序列为：

5’端引物即上游引物：5’-ACAACCTAACTTCTGCGCCA-3’，

3’端引物即下游引物：5’-TCAGGTTACCGTGGAGGCTA-3’，

探针：5’-FAM-CCTTTGTCGTTTTCACCTCGCTGGCTA-BHQ1-3’，

各引物和探针分别加入适量灭菌去离子水即ddH₂O稀释至10mmol/L后，漩涡振荡1min溶解，-20℃保存备用；

步骤二、提供前增菌

供试品溶液：取相当于包含中药制剂10g的中药预处理粉，置无菌锥形瓶中，加入TSB培养基至200mL，混匀，用超声波处理10min，得到供试品溶液；

供试品阳性对照菌液：向上述供试品溶液中加入1mL小于100cfu/mL的沙门氏菌菌液，得到供试品阳性对照菌液；

阳性对照菌液：无菌锥形瓶中加入TSB培养基至200mL，再加入1mL小于100cfu/mL的沙门氏菌菌液，得到阳性对照菌液；

阴性对照：以TSB培养基作为阴性对照；

上述溶液分别置于36℃恒温培养箱中过夜培养16h后，作为实验菌液，用于后续DNA提取；

步骤三、采用热裂解法提取沙门氏菌DNA

分别取上述增菌的实验菌液即供试品溶液、供试品阳性对照菌液、阳性对照菌液、阴性对照各1mL，置1.5mL无菌离心管中，1000rpm离心30s，上清液转移至另一1.5mL无菌离心管中，以12000rpm离心2min，弃上清，菌体沉淀以200μL无菌水重悬，于95℃水浴锅加热10min，再以12000rpm离心5min，取上清液作为PCR反应模板DNA溶液；检测完浓度及纯度后，-20℃保存备用；

步骤四、DNA浓度和纯度的测定

以紫外分光光度计测定DNA浓度及纯度；

步骤五、实时荧光PCR扩增

反应体系总体积为25μL，按以下比例配制PCR反应液：模板DNA溶液1μL、Taq酶0.2μL、10×PCR Buffer 5μL、dNTP Mix 1μL、上游引物1μL、下游引物1μL、探针0.5μL、增补液1μL、ddH₂O适量至25μL，

PCR反应条件：

i、95℃：3min预变性；

ii、95℃：10s变性；

iii、64℃：30s退火，采集荧光；以上ii、iii两步进行40次循环；

iv、停止；

检测过程中同时设置阳性对照、供试品阳性对照、阴性对照、空白对照；

计算PCR反应总管数N，按照上述反应体系配制N+1份PCR反应液于一个1.5mL无菌离心管中，充分振荡混匀后，低速离心10s，分装至PCR 8联反应管中，在阳性对照管中加入阳性对照DNA提取液，供试品管中加入供试品DNA提取液，供试品阳性对照管加入供试品阳性对照DNA提取液，阴性对照管加入阴性对照提取液，空白对照管中加入等体积水代替DNA提取液，盖上反应管盖；将PCR反应管中的液体充分混匀后，去除反应管中的气泡后，低速离心30s，备用；

打开荧光定量PCR仪，放入PCR反应管，关闭盖子，运行程序；待程序运行结束后，分析实验结果，确定阈值线，输出包括FAM荧光信号和Ct值的参数的报告；

步骤六、方法学控制：

以下条件有一条不满足时，结果视为无效：

a、空白对照：无FAM荧光信号检出，

b、阴性对照：无FAM荧光信号检出，

c、阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0，

d、供试品阳性对照：有FAM荧光信号检出，且FAM通道出现典型的扩增曲线，Ct值≤35.0；

步骤七、结果判定与结果表述：

a、如Ct值≤35.0，则判定为被检样品即所述中药制剂阳性，表述为“检出沙门氏菌”；

b、如Ct值≥40.0，则判定为被检样品即所述中药制剂阴性，表述为“未检出沙门氏菌”；

c、如35.0＜Ct值＜40.0，则重复试验一次，如再次扩增后Ct值仍为35.0＜Ct值＜40.0，则判定为被检样品即所述中药制剂可疑，表述为“沙门氏菌可疑”。