[发明专利]一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用

说明书

本公开属于生物分析技术领域，具体为一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用。包括双功能哑铃探针、信号探针1和信号探针2；所述双功能哑铃探针包括T7启动子区域，并修饰有一个8‑oxoG和一个脱氧肌苷；所述信号探针1和2的5'端分别被不同的荧光团修饰，在3'端分别被不同的淬灭剂修饰。首次证明了可控T7转录激活的循环级联扩增在单分子水平同时检测人类8‑氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人类烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)，该方法具有良好的特异性和灵敏性，对hOGG1的检出限为3.52×10^‑8U/μL，对hAAG的检出限为3.55×10^‑7U/μL，甚至可以在单细胞水平定量修复糖基化酶活性。

技术领域

本发明属于生物分析技术领域，具体为一种同时检测hOGG1和hAAG的荧光传感器及其检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

DNA双螺旋中杂环碱基的特定配对(即A与T，G与C)对于保存和传递人类基因组中编码的遗传信息至关重要。但是，杂环碱基的化学结构具有大量的亲核和氧化还原活性位点，这些位点经常受到各种外源性(例如，紫外线，遗传毒性化学物质和吸烟)和内源性(例如，活性氧和S-腺苷甲硫氨酸)的攻击，各种氧化损伤(例如，氧化碱基，无碱基位点和链断裂)和烷基化损伤(例如，烷基化碱基，脱氨基嘌呤和环状加合物)。其中，8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷(8-oxodG)是最丰富的氧化损伤，在DNA复制过程中可能与2'-脱氧腺苷(dA)错配，导致永久性的G：C→T：A转化突变，而N3-甲基-2'-脱氧腺苷(m3dA)是重要的烷基化病变，它可以进行自发的去嘌呤作用，从而阻断大多数聚合酶，阻碍DNA复制和转录。人8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶(hOGG1)和人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶(hAAG)是两种类型的修复糖基化酶，它们具有明显的不同功能和底物特异性，通过经典的碱基切除修复(BER)机制可分别催化修复两个主要的氧化和烷基化损伤。因此，同时检测hOGG1和hAAG活性对DNA损伤相关的生物医学研究和临床疾病治疗具有重要意义。

传统方法包括凝胶电泳偶联的放射性同位素标记，酶联免疫测定(ELISA)，质谱(MS)，和高效液相色谱(HPLC)。然而，基于凝胶的放射测定存在以下缺点：危险的辐射和耗时的操作；ELISA需要昂贵的抗体，并且可能会因多步洗涤过程中样品损失而被低估。此外，所有这些方法都是异质和半定量的。MS和HPLC具有较高的背景，这是由复杂的样品制备过程中的人工DNA损伤引起的。另外，还开发了几种新方法，包括比色法，电化学法，和荧光法。比色法可以直观地检测hOGG1的活性，但是DNA-AuNP探针的制备既费时又费力。电化学方法利用尿嘧啶水解引发的DNA双链解开释放的单链DNA(ssDNA)和随后在石墨烯电极沉积中鸟嘌呤的氧化来定量尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)的活性，但是修饰电极的制备和DNA探针的固定相对繁琐和复杂。荧光分析利用8-oxoG修复诱导的基于量子点的纳米传感器组装来检测hOGG1活性，但复杂的探针修饰和昂贵的荧光纳米材料限制了其广泛应用。为了提高灵敏度，引入了一些脱氧核糖核苷酸扩增技术来检测修复糖基化酶活性，包括环介导的等温扩增(LAMP)，滚环扩增(RCA)，和内切核酸酶(例如Fok I)辅助信号扩增(EASA)。但是，这些方法涉及复杂的扩增程序，多种引物/酶以及非选择性荧光染料，非特异性聚合和消化引发的高背景。此外，所有上述方法只能检测一种类型的修复糖基化酶。

为了解决上述问题，多种DNA聚合扩增技术(例如聚合酶链反应(PCR)，链置换扩增(SDA)，和指数等温扩增反应(EXPAR))引入生物传感系统中，以探索出色的检测能力。然而，发明人发现，由于空间位阻，变异的化学微环境和拥挤的表面效应，在生物传感器的界面上实现探针结合和信号放大不可避免地会导致结合效率和酶动力降低。尽管纳米结构界面工程的改进可以使目标最大化识别效率，但表面微/纳米加工的可变性可能会显著影响目标物在复杂基质中的定量和重现性。