[发明专利]一种生产L-高丝氨酸的基因工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一种高产L‑高丝氨酸的基因工程菌，其中所述菌中L‑高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达被减弱或消除，进一步强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC、高丝氨酸脱氢酶解反馈抑制突变体基因hom、过表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因thrA以及转运蛋白基因。本发明构建的L‑高丝氨酸高产菌株能够产生较高水平L‑高丝氨酸，在最佳实施例中本发明的基因工程菌经过72 h发酵，L‑高丝氨酸含量可达63.2±5.4g/L。

技术领域

本发明属于合成生物学和代谢工程技术领域，具体涉及通过代谢工程的策略高产L-高丝氨酸的方法。

背景技术

高丝氨酸是一种重要的非蛋白质氨基酸，参与体内多种生理生化反应和生物代谢过程，具有重要的生理功能和应用价值。由于高丝氨酸及其衍生物具有丰富的生物活性，在食品、农业和医药等领域具有广泛的应用。高丝氨酸可作为抗真菌药物，有效制止分枝杆菌结核病等；作为医药中间体，可用于制备多种生物活性药物；此外，高丝氨酸还可作为重要中间体用于合成丙烯酸、3-羟基丙酰-CoA、聚-3-羟基丙酸酯和1，2-丙二醇等高附加值化学品。近年来，高丝氨酸被开发用于广谱除草剂L-草铵膦的合成过程。近年来，随着对高丝氨酸研究的不断深入，多种高丝氨酸及其衍生物产品被开发并应用于工业生产中，需求量逐年增加，具有广阔的应用前景。

目前，高丝氨酸主要通过以L-甲硫氨酸或天冬氨酸为原料的化学法合成。然而化学合成过程中需要使用碘化物和大量有机溶剂，并且生成硫化物，从而造成极大的环境污染。相比之下，微生物发酵法具有成本低、条件温和、环境污染少等许多优点，已成为生产各类氨基酸的首选工艺。近年来，利用微生物发酵法生产高丝氨酸越来越引起人们的广泛关注。Li等利用大肠杆菌构建了一株产高丝氨酸的工程菌株，高丝氨酸产量达到39.54 g/L（Li H, et al. Metabolic engineering of Escherichia coli W3110 for L-homoserine production, Process Biochemistry, 2016, 51: 1973-1983.）。然而由于高丝氨酸对大肠杆菌具有较高的细胞毒性，目前高丝氨酸产量仍然较低，难以满足工业化生产需求。因此，开发一株高产高丝氨酸的工业菌株对推动高丝氨酸产业发展具有重要意义。本发明以谷氨酸棒杆菌为宿主，利用代谢工程和合成生物学的方法，构建了一株高产高丝氨酸的工程菌株，为发酵法工业生产高丝氨酸提供了重要的理论基础和示范。

发明内容

目前，高丝氨酸主要通过化学合成的方法进行生产，存在工艺复杂、技术壁垒高、安全性低、环境污染大等问题，也限制了产品在食品、医药等行业中应用。利用环境友好的微生物发酵法制备L-高丝氨酸提供了一条绿色可行的替代方案，但目前也存在菌种资源缺乏，生产技术水平相对落后等限制因素。针对现有技术的问题，本发明的目的是提供一种L-高丝氨酸生产菌株及其构建方法。

本发明所提供的一种L-高丝氨酸生产菌株，其特征在于在基因组水平上敲除或弱化L-高丝氨酸降解途径相关基因，利用穿梭载体和在基因组水平过表达或强化多个L-高丝氨酸生物合成途径相关基因，并且生产菌株中多个与L-高丝氨酸合成代谢相关的基因被突变，获得产L-高丝氨酸的基因工程菌。

本发明首先提供一种高产L-高丝氨酸的基因工程菌，其中所述菌选自埃希氏属（Escherichia）、棒杆菌属（Corynebacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）或短杆菌属（Brevibacterium），其中所述菌中L-高丝氨酸激酶编码基因thrB的表达被减弱或消除。优选地，所述菌为棒杆菌属。更优选地，所述菌为谷氨酸棒杆菌。

优选地，所述菌中强化表达天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC，更优选地，所述天冬氨酸激酶解反馈抑制突变体基因lysC存在C932T的突变。