[发明专利]一种检测肠道病毒CVB3的方法

说明书

本发明属于电化学和分析化学领域，本发明的目的在于提供一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。利用重组酶聚合酶扩增，将扩增产物原位连接到电极上，扩增产物上的生物素与溶液中的链霉亲和素标记的碱性磷酸酯酶作用，碱性磷酸酯酶再催化溶液中的底物对氨基苯基磷酸单钠水解生成游离的电子供体对氨基苯酚，对氨基苯酚增强修饰电极的光致电化学反应从而产生增强的光电信号，实现对CVB3的检测，该方法具有高的灵敏度，方法简单。

技术领域

本发明属于分析化学与光致电化学传感器领域，具体为一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。

背景技术

柯萨奇B3病毒(Coxsackievirus B3，CVB3)是肠道病毒属的一种，具有较高的发病率和死亡率。这种小型的单链RNA病毒会引起多种症状。比如：常见于五岁以下的儿童的手足口病，重度急性弛缓性麻痹，脑膜炎以及新生儿器官衰竭。但是发展快速、灵敏的CVB3分子诊断技术具有挑战性。本发明的目的在于提供一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。利用重组酶聚合酶扩增(RPA)，将扩增产物原位连接到电极上，扩增产物上的生物素与溶液中的链霉亲和素标记的碱性磷酸酯酶作用，碱性磷酸酯酶再催化溶液中的底物对氨基苯基磷酸酯水解生成游离的电子供体对氨基苯酚，对氨基苯酚增强修饰电极的光致电化学反应从而产生增强的光电信号。在最佳条件下，光致电化学信号与CVB3的浓度在0.1fM～100fM范围内呈现出良好的线性关系，LOD为30aM。此外，该方法具有良好的稳定性、重现性和选择性，为CVB3检测提供了一种新的思路，为进一步研究便携式临床样品处理和分析装置奠定了基础。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。

本发明的目的是这样实现的：用ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs修饰碳糊电极，构建光致电化学传感器以实现对CVB3的测定；一种基于原位重组酶聚合酶扩增光致电化学生物传感器检测CVB3的方法。首先，利用光电活性物质修饰电极，然后在电极上固定正向引物，当有目标物存在时，扩增得到含生物素的产物，将链霉亲和素标记的碱性磷酸酯酶识别并捕获在电极上，再水解溶液中的底物对氨基苯基磷酸酯，生成电子供体对氨基苯酚，对氨基苯酚增强光电活性物质ZnSeNSs/AuNPs/BNNS的光电信号，根据光电信号的强弱实现对CVB3的测定，具体包括如下步骤：

复合材料ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs的制备

称取20mg的氮化硼粉末加入到盛有50.0mL的乙二醇溶液的烧杯中，超声剥离2h后使氮化硼均匀的分散在溶液中，制得氮化硼纳米片。之后将该烧杯置于磁力搅拌器上匀速搅拌，同时用制备的5mM的氢氧化钠溶液滴定，直至溶液pH达到10.0。随后，将烧杯转移到恒温水浴加热搅拌器上，并向烧杯中加入2.0ml 0.0240mol/L氯金酸，在100℃恒温水浴中加热4h，加热完成后，将烧杯中的溶液分装到离心管中并分别离心三次(12000r/min，10min)。离心后，收集沉淀物在80℃下干燥2h。获得了AuNPs/BNNSs材料。称取0.0150gAuNPs/BNNSs，分散于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，将分散液置于4℃冰箱中使用。称取0.0150g块状硒化锌分散于DMF中，超声剥离8h后得到ZnSeNSs。最后，吸取2mL AuNPs/BNNSs和2mL ZnSeNSs分散液转移到同一离心管中，超声波振动使溶液均匀混合，制得ZnSeNSs/AuNPs/BNNSs复合材料。

CVB3含量的测定