[发明专利]具有启动子和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，该片段命名为P2454，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No.1所示。本发明还公开了一种枯草芽孢杆菌高效分泌表达蛋白的信号肽，该信号肽命名为SP2454，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还公开了含上述DNA片段和上述信号肽的重组载体或重组工程菌在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体，并成功应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现了高效生产。本发明提供的启动子特征揭示它在工业生产中具有重要应用价值。

技术领域

本发明属于基因工程领域和分子生物学技术领域，涉及一种DNA片段及其应用，具体说，涉及一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。

背景技术

枯草芽孢杆菌是一种重要的原核表达宿主，其遗传背景清晰，遗传操作简单，具有较强的蛋白分泌能力，不具有致病性，发酵工艺成熟。广泛用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等工业用酶。

启动子是直接影响基因表达水平的重要的基因组调控元件，在细菌中，RNA聚合酶和相关的sigma因子识别启动子，并通过调节蛋白与启动子内特定位点的结合而被招募。迄今为止，已有三种启动子用于枯草杆菌异源蛋白的高水平表达：组成性启动子、诱导特异性启动子和自诱导启动子。组成型启动子，如P43启动子，会影响菌体生长，不适合生产对宿主有毒的物质。诱导型启动子(如Pspac和Pxyl)是使用最广泛的类型，但是诱导物如IPTG和木糖一般价格昂贵，会增加工业生产成本。自诱导启动子是大规模蛋白质生产的理想选择。这样的启动子可以诱导目标基因从对数晚期到稳定期的表达，而不需要诱导物，这有助于以较低的成本高效生产异源蛋白，然而，低活性是该类启动子目前广泛应用的一个障碍。因此有必要找到更高效、适合于工业培养基生产表达的启动子。除启动子外，核糖体结合位点(RBS)、SD序列和信号肽等元件也会影响蛋白的表达。通常根据转录组测序结果，可以筛选到转录水平较高的启动子，然而进行蛋白表达时还需要对上述元件进行进一步的优化。

果胶是一类广泛存在于植物细胞壁的初生壁和细胞中间片层的杂多糖，根据果胶分子主链和支链结构的不同,可以将其分为3类:同型半乳糖醛酸聚糖(Homogalacturonan,HG)，鼠李半乳糖醛酸聚糖I(Rhamngalacturonan I,RGI)，鼠李半乳糖醛酸聚糖II(Rhamngalacturonan II,RGII)。该酶作用于果胶可以释放不同聚合度的寡糖，这些寡糖具有益生作用(Inês R Silva,Jers C,Otten H,et al.Design of thermostablerhamnogalacturonanlyase mutants from Bacillus licheniformis by combination oftargeted single point mutations[J].Applied Microbiology and Biotechnology,2014,98(10):4521)但检索发现，利用在枯草芽孢杆菌胞外蛋白质组信息，克隆胞外含量较高蛋白的启动子和信号肽编码区的DNA片段并使用该启动子及其信号肽编码构建蛋白分泌表达载体应用于鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的分泌表达，实现高效生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶的文献或专利还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种枯草芽孢杆菌具有启动子功能和编码信号肽功能的DNA片段及其在生产鼠李半乳糖醛酸聚糖裂解酶中的应用。

本发明所述枯草芽孢杆菌具有启动子功能的DNA片段，其特征在于：该DNA片段命名为启动子P2454，其核苷酸序列为如下任一序列：

(1)如序列表SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；

(2)与序列表中SEQ ID No.1所示的DNA序列具有90％以上同源性，且具有相同功能的DNA序列；