[发明专利]用于Nrf2降解剂的筛选体系、表达载体、宿主细胞及方法

说明书

本发明提供一种用于Nrf2降解剂的筛选体系，所述的筛选体系包括A荧光蛋白基因序列、B荧光蛋白与含Nrf2蛋白的融合蛋白基因序列、以及IRES基因序列，A荧光蛋白基因序列、融合有B荧光蛋白的Nrf2蛋白基因序列独立表达，且由IRES基因序列连接。本发明能够高效筛选基于Nrf2蛋白降解的Nrf2降解剂，是一种适用于细胞水平的定量筛选Nrf2降解剂的体系，可应用于具有NRF2相关抗肿瘤药物的天然药物和人工合成的化合物的筛选。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于Nrf2降解剂的筛选体系、宿主细胞及方法。

背景技术

核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2related factor 2，简称Nrf2)是多种细胞保护反应中主要的调节因子，能够维持细胞中的氧还平衡及代谢稳态中起着关键作用。通常情况下，Nrf2受到E3泛素化连接酶Kelch样ECH相关蛋白1(Keap1)调控降解，当受到氧化压力时Nrf2会从Keap1中被释放，与抗氧化反应元件ARE(antioxidantresponse element)相结合，通过ARE调控解毒相关酶(UGTs，NQO1等)和抗氧化相关酶(谷胱甘肽合成酶，谷胱甘肽还原酶以及过氧化酶家族等)等蛋白的表达，在癌症预防与治疗中有很重要的意义。

数十年的研究证明，Nrf2活性可改善压力下的细胞适应性，并有助于正常的细胞生理学。目前已经有226项TCGA研究对Keap1-Nrf2这一信号通路进行研究，发现在肺癌(LUSC和LUAD；分别为31.4％和24％)，子宫癌(20.6％)，头和颈部癌(17.4％)，食道癌(19.8％)和膀胱癌(14.8％)中该信号通路存在遗传或者拷贝数的变化。Nrf2的不断积累特别是在核中的积累能够促进Nrf2下游靶基因的表达，包括抗氧化相关基因(SLC7A11，GCLC，GCLM，GPX2，HMOX1，PRDX1，SRXN1，TXN1和TXNRD1等)、排毒相关基因(AKR1B10，AKR1C1，AKR1C2，KR1C3，和NQO1等)和代谢重编程相关基因(G6PD，IDH1，ME1，PGD，TALDO1和TKT等)，促进肿瘤的生长跟转移。现有的报导表明，在鳞状细胞肺癌、还有部分乳腺癌、前列腺癌、口腔癌等多种其他肿瘤中发现Nrf2异常活跃，同时Nrf2高表达也与一些肿瘤的不良预后相关。因此，抑制Nrf2可以帮助提高肿瘤对一些抗肿瘤疗法的敏感性。然而由于缺乏Nrf2的晶体结构，现有的一些Nrf2抑制剂的作用机制是未知的，同时这类抑制剂的特异性也不高。因此，新型Nrf2抑制剂的发现以及其筛选方法的建立将大大有利于靶向肿瘤中高表达的Nrf2从而起到治疗作用。

内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)，由于可以介导目的基因之间翻译的内部起始，使位于IRES上游的基因跟下游的基因表达互相独立，而被利用与多顺反子的共表达。通过在B荧光蛋白融合的Nrf2蛋白序列与A荧光蛋白序列之间插入IRES序列即可通过相对于B荧光蛋白荧光信号与A荧光蛋白荧光信号的相对强度反映细胞中Nrf2水平。基于以上的原理，本发明建立了一种基于荧光双顺反子报告系统的Nrf2降解筛选体系，并用已知的Nrf2抑制剂验证了该系统用于筛选Nrf2抑制剂的可行性。

发明内容

本发明的目的是为了克服上述现有技术中的至少一个缺点，提供一种简便、直观、高效的用于筛选Nrf2降解类抑制剂的荧光双顺反子报告系统及其构建方法跟用途，从而实现了对能否引起Nrf2降解而抑制Nrf2活性的抑制剂的筛选与评价。

本发明提供了一种用于Nrf2降解剂的筛选体系，所述的筛选体系包括A荧光蛋白基因序列、B荧光蛋白与含Nrf2蛋白的融合蛋白基因序列、以及内部核糖体进入位点IRES基因序列，A荧光蛋白基因序列、融合有B荧光蛋白的Nrf2蛋白基因序列独立表达，且由IRES基因序列连接。

本发明提供的筛选体系为一段基因表达序列，内部核糖体进入位点IRES基因序列，含Nrf2蛋白的表达序列，和两个荧光蛋白表达序列。