[发明专利]一种参与吩嗪类物质myxin自我抗性的外排泵LexABC及其编码基因与应用

说明书

本发明公开一种参与吩嗪类物质myxin自我抗性的外排泵LexABC及其编码基因与应用。该外排泵LexABC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。提供lexA、lexB、lexC基因；将所述的lexA、lexB、lexC基因与载体pBBR1‑MSC5通过无缝连接克隆，得到重组质粒pBBR‑lexABC；将重组质粒pBBR‑lexABC转化至抗生素溶杆菌OH13，得到LexABC过表达的重组菌株。本发明通过过表达LexABC蛋白，可增强myxin产生菌对myxin的抗性，保护myxin产生菌免受来自高浓度myxin的毒性，对于培养myxin高产菌株及开发myxin产生菌为生物农药具有重要实际意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种参与吩嗪类物质myxin自我抗性的外排泵LexABC及其编码基因与应用。

背景技术

溶杆菌属(Lysobacter)细菌属于黄单胞科。目前，国际上已鉴定的溶杆菌属细菌有73个种，其中产酶溶杆菌(L.enzymogenes)、抗生素溶杆菌(L.antibioticus)、变棕溶杆菌(L.brunescens)和胶状溶杆菌(L.gummosus)是溶杆菌属的典型种，它们具有高效抗菌活性和植物病害生防潜力，是一类新型植物病害生防细菌。这类细菌对植物病原真菌、卵菌、革兰氏阴性细菌(G^－)、阳性细菌(G⁺)和线虫都有显著的拮抗作用，其作用机理为：(1)产生小分子抗菌次生代谢物质；(2)分泌产生大量胞外酶，包括几丁质酶、β-1,3-葡聚糖、蛋白酶和纤维素酶；(3)诱导植物产生抗病性；(4)较好的定殖能力。

我们在前期研究工作中从作物根际土壤分离得到一株抗生素溶杆菌，命名为OH13。OH13对多种植物病原真菌、细菌均具有较强的拮抗活性。我们从OH13的培养液中分离鉴定了六种吩嗪类物质，分别为：(1)1-羟基-6-甲氧基-5,10-二氧吩嗪；(2)1-羟基-6-甲氧基-10-氧基吩嗪；(3)1,6-二羟基-5,10-二氧吩嗪；(4)1,6-二甲氧基-10-氧基吩嗪；(5)1,6-二甲氧基吩嗪；(6)1-羟基-6-甲氧基吩嗪。其中化合物1(即1-羟基-6-甲氧基-5,10-二氧吩嗪)与已报道的myxin结构一致，对多种植物病原细菌都具有很强的拮抗活性，尤其是对水稻黄单胞菌。在前期工作中，我们已对myxin的生物合成机制进行了解析，揭示了包含10个合成基因的基因簇(LaPhz)负责myxin的生物合成。Myxin等芳香族氮氧化物能够在有氧和无氧条件下引起由生物还原激活和自由基介导的DNA链断裂，这一类物质在自然界存在较少，但往往具有很强的生物活性。因此myxin有望成为一种有重要作用价值的农用抗生素或抗菌药物，但是由于myxin在抗生素溶杆菌中的产量仅约7μg/mL，远远不能满足工业化生产的需要，而高浓度myxin对于产生菌本身也具有毒害作用。因此明确抗生素溶杆菌中myxin的自我抗性机制，对于提高其产量具有重要意义，也是我们面临的重要任务。

产生抗生素的微生物已经进化出多种自我抗性机制来防止自我毒性作用，例如抗生素外排、抗生素修饰、自我牺牲、目标修复或保护。自我抗性机制之一是外排泵将有毒化合物输送到细胞外。外排泵根据其蛋白质序列被分为五大类，它们是RND(resistance-nodulation-cell division)、MFS(major facilitator superfamily)、MATE(multidrugand toxic compound extrusion)、SMR(small multidrug resistance)和ABC(ATP-binding cassette)家族。