[发明专利]一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器、检测方法和应用

说明书

本公开涉及DNA甲基化检测技术领域，具体为一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器、检测方法和应用。荧光生物传感器包括限制性核酸内切酶HpaII、含有AP位点的信号探针、核酸内切酶IV和链霉亲和素修饰的磁珠；所述探针由生物素和Cy5共同修饰。将核酸内切酶IV(Endo IV)辅助信号放大与单分子荧光检测相结合，用于DNA甲基化的超灵敏检测。该方法操作简单、灵敏度高、特异性好，甚至能够定量单个癌细胞中的DNA甲基化水平，在疾病诊断和临床医学研究中具有巨大潜力。

技术领域

本发明涉及DNA甲基化检测技术领域，具体为一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器、检测方法和应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

DNA甲基化是哺乳动物基因组中最常见的表观遗传修饰之一，主要发生在胞嘧啶/鸟嘌呤二核苷酸(CpG)对中胞嘧啶残基的第五位碳原子上。通过将甲基共价添加到胞嘧啶上，DNA甲基化影响基因表达的可遗传状态，而无需改变DNA序列。正常的DNA甲基化状态在各种生理过程中起着至关重要的作用，包括胚胎发育，基因组印记，分化，细胞记忆和衰老等。然而，异常的DNA甲基化状态可能导致基因表达失调，从而引发多种疾病包括癌症，例如肺癌，肝癌，肾癌，结肠癌，乳腺癌和宫颈癌等。因此，准确而有效的检测DNA甲基化对表观遗传学的研究及相关临床应用具有十分重要的意义。

迄今为止，已发展出多种DNA甲基化检测方法，主要是基于对DNA中胞嘧啶(C)和甲基胞嘧啶(mC)的区分。传统的检测方法包括液相色谱，毛细管电泳，质谱以及凝胶电泳等，虽然能够直接检测DNA甲基化，但存在仪器昂贵，灵敏度低，特异性差，操作程序复杂等缺点。更重要的是，这些方法灵敏度低，因此需要大量的DNA样品进行甲基化分析。考虑到人类基因组中甲基化的胞嘧啶仅占基因组DNA总碱基数的1％这一实际情况，因此迫切需要发展一种操作简单、灵敏度高、选择性好的DNA甲基化测定新方法。基于聚合酶链反应(PCR)已发展出多种扩增和灵敏检测DNA甲基化的方法，包括甲基化特异性聚合酶链反应(MS-PCR)、甲基化敏感随机扩增聚合酶链反应(MS-AP-PCR)、连接介导的聚合酶链反应(LM-PCR)等，这些扩增方法不可避免存在一些明显的缺点，例如反应步骤复杂，酶/探针种类繁多，固有的非特异性扩增以及相对较高的背景信号，费时费力的预处理过程，严格的反应条件和引物设计，假阳性和非特异性扩增等，需精确控制反应温度和循环数的要求极大地限制了其广泛应用。

发明内容

为了解决上述问题，本公开的目的是提供一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器、检测方法和应用，将核酸内切酶IV(Endo IV)辅助信号放大与单分子荧光检测相结合，用于DNA甲基化的超灵敏检测。该方法操作简单、灵敏度高、特异性好，甚至能够定量单个癌细胞中的DNA甲基化水平，在疾病诊断和临床医学研究中具有巨大潜力。

具体地，本公开的技术方案如下所述：

在本公开的第一方面，提供一种检测DNA甲基化的荧光生物传感器，包括限制性核酸内切酶HpaII、含有AP位点的信号探针、核酸内切酶IV和链霉亲和素修饰的磁珠；所述信号探针由生物素和Cy5共同修饰。

在本公开的第二方面，提供一种检测DNA甲基化检测试剂盒，所述试剂盒包括限制性内切酶HpaII、10×Cutsmart缓冲液、牛血清白蛋白、生物素和Cy5共修饰的含有AP位点的信号探针、链霉亲和素修饰的磁珠、1×BW缓冲液、10×NEB缓冲液3、核酸内切酶Ⅳ。

在本公开的第三方面，一种检测DNA甲基化的方法，所述方法包括：限制性核酸内切酶HpaII切割甲基化状态的DNA得到单链DNA，单链DNA与含有AP位点的信号探针形成双链体，并通过生物素-链霉亲和素的相互作用，将双链体捕获到磁珠表面，添加核酸内切酶IV以裂解双链体中的AP位点，释放Cy5标记的裂解信号探针和单链DNA。