[发明专利]一种三叶青试管苗离体保存的方法

说明书

本发明公开了一种三叶青试管苗离体保存的方法，属于植物的栽培技术领域，包括以下步骤：选取三叶青茎尖作为外植体，进行预培养后进行第二次培养；将第二次培养的茎尖用海藻酸钠包埋球；将含茎尖的包埋球取出，放置于无菌培养皿上的无菌滤纸上,在无菌空气流中干燥1‑2h无菌空气流干燥后，将包埋球装入冷冻管，每个冷冻管装10‑20个包埋球；将装有包埋球的冷冻管置于冷冻管架或沙袋后投入液氮进行超低温保存。本发明未形成愈伤组织，避免产生遗传变异，遗传稳定性好，再生苗恢复生长良好，植株再生率可达99％以上。

技术领域

本发明涉及植物的栽培技术领域，特别是涉及一种三叶青试管苗离体保存的方法。

背景技术

三叶青(Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg)别名三叶崖爬藤、金线吊葫芦，属鼠李目，葡萄科草质藤本。三叶青草质藤本，小枝纤细，有纵棱纹，无毛或被疏柔毛。卷须不分枝，相隔2节间断与叶对生。叶为3小叶，小叶披针形、长椭圆披针形或卵披针形，长3～lOcm，宽1.5～3cm，顶端渐尖，稀急尖，基部楔形或圆形，侧生小叶基部不对称，近圆形，边缘每侧有4～6个锯齿，锯齿细或有时较粗，上面绿色，下面浅绿色，两面均无毛；侧脉5～6对，网脉两面不明显，无毛；叶柄长2～7.5cm，中央小叶柄长0.5～1.8cm，侧生小叶柄较短，长0.3～0.5cm，无毛或被疏柔毛序腋生，长1～5cm，比叶柄短、近等长或较叶柄长，下部有节，节上有苞片，或假顶生而基部无节和苞片，二级分枝通常4，集生成伞形。花期4～6月，果期8～11月。为我国特有药用植物,广泛分布于长江以南各省份，主要有浙江、江西、福建、湖南、湖北、广东、广西、贵州、重庆、四川、西藏、云南、海南和台湾等地区，常生于山坡林下的灌丛中或山谷溪边林下的岩石缝中，生长海拔300～1300m。

三叶青全草均可入药，以地下块根和果实的药用效果最好。其性平、味微苦,具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效,主治毒蛇咬伤、扁桃体炎、淋巴结结核、跌打损伤、小儿高热惊厥等疾病。目前临床上还应用于抗癌、抗艾滋病毒，治疗血液病、心脑血管疾病、肝炎、病毒性脑膜炎等疾病。

目前三叶青主要依赖于野生挖掘,近年来,由于过度采挖和生境破坏，致使铁三叶青野生资源已濒临灭绝，人工栽培己刻不容缓,但人工栽培存在种苗供应不足，通过组培的方法快速繁殖种苗有很大的市场价值。

离体继代培养技术正日益成为试管苗保存的常用手段。但利用继代培养的方法进行试管苗保存，一个比较普遍的问题就是继代频繁。每一次继代都可能造成交叉污染，而当保存量较大时，继代培养所消耗的人力和物力成本很高。不仅如此，一些保存的植物组织培养物，经过多次继代还会引发遗传变异。国内外对三叶青的研究主要集中在临床应用、化学成份以及药理作用方面，组织培养、快繁技术目前有少量报道，但有关其试管苗保存的离体保存技术以及其遗传评价均未见报道。而且，三叶青种质资源田间种植难度大，保存工作量大，易受环境气候及病虫害影响，而组织培养正常继代保存转接频繁、成本高。

发明内容

本发明的目的是提供一种三叶青试管苗离体保存的方法，提供一种不但保存15个月后植株生长正常，而且保存材料的后代未发生遗传性变异的三叶青试管苗的离体保存方法。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种三叶青试管苗离体保存的方法，包括以下步骤：

(1)选取三叶青茎尖作为外植体，在质量浓度75％酒精中浸泡，无菌水冲洗，滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗，再滴加质量浓度0.1％升汞，无菌水冲洗，剪成0.5-1.0cm长接种在第一培养基中，培养；

(2)在无菌条件下从生长健壮的无菌苗上切取直径大小1-3mm的离体茎尖为材料，将离体茎尖置入第二培养基，培养；