[发明专利]一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法

说明书

一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法，包括：离心步骤，包括使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心，分离得到外周血单个核细胞；多肽培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，培养过程中，分多次加入待测抗原多肽、培养基、细胞因子，培养得到被多肽刺激的外周血单个核细胞；树突状细胞培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，诱导培养，得到树突状细胞；检测步骤，将被多肽刺激的外周血单个核细胞与树突状细胞混合孵育，检测抗原多肽是否具有免疫原性。通过短时间离心后，进行多肽刺激培养外周血单个核细胞，可快速检测待测抗原的免疫原性，显著简化操作步骤，缩短检测时间，并且只需少量外周血，显著降低样本的获取难度。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法。

背景技术

关于新生抗原的免疫原性的检测，早期主要采用肿瘤浸润淋巴细胞(TumorInfiltrating Lymphocyte，TIL)来检测新生抗原的免疫原性。80年代科学家们发现手术切除的肿瘤组织中，大部分是肿瘤细胞，也有少部分淋巴细胞。科学家可以通过一些培养方法把这些肿瘤组织中的淋巴细胞扩增起来(Rosenberg et al.,2011)。这些淋巴细胞中有些是能够杀伤肿瘤细胞的新生抗原特异性T细胞。具体培养方法如下：首先，从进行手术的病人身上采集新鲜的肿瘤组织，马上将肿瘤组织运输到实验室，将手术切除的肿瘤组织(1-2mm³)分割成很多小块，每一块放在不同的培养孔中，待各孔的TIL长满后，筛选出含有新生抗原特异性T细胞的TIL，再大量扩增。如果能从TIL中找到新生抗原特异性T细胞，则证明新生抗原具有免疫原性。通过测序、生信分析和新生抗原预测算法，获知新生抗原序列，将它们的DNA序列(minigene)串联起来，形成串联小基因(TMG)，然后转录成RNA，再通过电转的方式导入抗原呈递细胞，将各个培养孔里的TIL分别与抗原呈递细胞共孵育做酶联免疫斑点法(ELISPOT)检测，出现阳性结果则表明这个孔的TIL中含有新生抗原特异性T细胞，至于是哪条新生抗原，还需要将串联小基因中各每个新生抗原，分别合成多肽，负载至抗原呈递细胞，逐个进行ELISPOT检测。最后才能知道这一孔TIL中含有的新生抗原特异性T细胞识别的到底是哪条新生抗原，从而确定哪条新生抗原具有免疫原性。

研究者们发现在肿瘤患者的外周血中也存在新生抗原特异性T细胞，也就是说可以采用外周血样品来检查新生抗原的免疫原性。研究者们首先从PBMC中分选出CD8+及PD-1+双阳性细胞，扩大培养到一定数量，采用与上述类似的DNA序列串联的方式，将新生抗原DNA序列串联起来，形成TMG，然后转录成RNA，再通过电转的方式导入抗原呈递细胞，将导入了不同TMG的抗原呈递细胞分别与CD8+及PD-1+双阳性细胞共孵育做ELISPOT检测。可以找到ELISPOT阳性的TMG，至于是哪条新生抗原，还需要将TMG中各每个新生抗原，分别合成多肽，负载至抗原呈递细胞，逐个进行ELISPOT检测。最后才能知道哪条新生抗原具有免疫原性。操作过程繁琐，而且耗时较长。

发明内容

根据第一方面，一种实施例中提供一种使用外周血检测抗原免疫原性的方法，包括：

离心步骤，包括使用密度梯度离心管对外周血样本进行离心，分离得到外周血单个核细胞；

多肽培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，培养过程中，分多次加入待测抗原多肽、培养基、细胞因子，培养得到被多肽刺激的外周血单个核细胞；

树突状细胞培养步骤，包括取部分外周血单个核细胞，诱导培养，得到树突状细胞；

检测步骤，将被多肽刺激的外周血单个核细胞与树突状细胞混合孵育，检测抗原多肽是否具有免疫原性。

依据上述实施例的方法，通过短时间离心后，进行多肽刺激培养外周血单个核细胞，可快速检测待测抗原的免疫原性，显著简化操作步骤，缩短检测时间，并且只需少量外周血，显著降低样本的获取难度。

附图说明

图1为实施例1的ELISPOT检测斑点数结果图。