[发明专利]海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用

说明书

本发明提供海葵多肽Ap‑TxⅠ及其制备方法与应用。本发明利用高通量转录组学从套膜海葵(Aiptasia pallida)中发现海葵多肽Ap‑TxⅠ，其序列为SGACAEICVHRCIPSCNFACCVAR，形成3个二硫键。采用多肽固相合成法(SPPS)合成线性肽Ap‑TxⅠ，经二硫键定向氧化法获得后含3个二硫键的氧化肽Ap‑TxⅠ(二硫键方式C1‑C6，C2‑C5，C3‑C4)，再采用高效液相色谱纯化。本发明合成的多肽Ap‑TxⅠ具有高效杀虫效果，且对哺乳动物毒性小，可为研发新型、高效、安全生物杀虫剂奠定良好基础。

技术领域

本发明涉及天然药物技术领域，特别涉及海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，随着化学农药的滥用，农业污染问题日益严重，直接威胁农业生态安全和农业可持续发展，进而带来食品安全问题影响人类健康。如何解决农业环境危机和生态安全问题迫在眉睫，由此对新型、高效、安全生物杀虫剂的需求非常迫切。目前，捕食昆虫的动物通常能分泌多肽类毒素，其通过昆虫的特异性离子通道或受体而起到毒杀和捕获猎物，但其对哺乳动物的毒性很小或无毒副作用。其中，已有文献报道的有海葵、芋螺、蝎子、蜘蛛和捕食性螨等均能够分泌多肽类毒素。因此，开展从海葵等海洋有毒生物资源中寻找杀虫活性多肽已成为高效安全杀虫剂研究的热点之一。

海葵(Sea anemone)又名海菊花，属于刺细胞动物门珊瑚虫纲，是原始的后生海洋动物，在全球已记录海葵目1100余种，分属于50科约400属。中国的海葵品种约占世界的1/10，广泛分布在温热带和热带海域。海葵触手上具有刺细胞能够分泌毒液捕食鱼、贝类、桡足类、甲壳类动物以及蠕虫，其毒液中富含各种多肽毒素成分，是重要的海洋药物资源。黄海葵为沿海地区的一味中药，全体入药，其性味为咸、平，归肝，脾和大肠经。《中华本草》和《中国药用动物志》记载海葵具有收敛固涩、燥湿杀虫等功效，中医用来治疗脱肛、痔疮、绕虫病等。《青岛中草药手册》记载治蛲虫病：将海葵1块塞入肛门，每晚1次，连用1周。现代药理学研究也表明，海葵多肽毒素具有杀虫、抗肿瘤、降压、抗菌、镇痛和神经抑制的作用。急需探索具有高效杀虫的海葵多肽。

发明内容

鉴于此，本发明提出海葵多肽Ap-TxⅠ及其制备方法与应用，海葵多肽Ap-TxⅠ具有高效杀虫效果。

本发明的技术方案是这样实现的：

海葵多肽Ap-TxⅠ，其氨基酸序列为

SGACAEICVHRCIPSCNFACCVAR，具有6个半胱氨酸，形成3个二硫键。

本发明提供海葵多肽Ap-TxⅠ的制备方法，包括以下步骤：

(1)取王树脂，用二氯甲烷浸泡；

(2)加入哌啶脱除9-芴甲氧羰基，然后用N，N-二甲基甲酰胺洗涤；

(3)加入Fmoc-L-丙氨酸、1-羟基苯并三唑、N,N'-二异丙基碳二亚胺，用N，N-二甲基甲酰胺作为溶剂，反应0.8-1.5h；再重复步骤(2)、(3)；得到反应后的树脂；

(4)将反应后的树脂用体积比为93-95：5-7的三氟乙酸和二氯甲烷混合溶液切割8-12min，重复2-4次；

(5)将步骤4得到的树脂用N，N-二甲基甲酰胺浸泡，用三乙胺调节pH值为7.8-8.2，搅拌氧化反应8-16h；

(6)将步骤5得到的树脂用93-97v/v％三氟乙酸水溶液切割2～3h，乙醚沉降得到产物A；

(7)将步骤6得到的产物A，冻干，溶解到18-22v/v％乙腈水溶液，用碳酸氢铵调节pH值为7～8，搅拌氧化反应8-16h，得到产物B；

(8)将步骤7得到的产物B，溶解到18-22v/v％乙腈水溶液，用碘醇溶液滴加到溶液里，得到产物C，纯化、干燥，得目标产品。