[发明专利]一种可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制备方法与应用

说明书

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种可溶性融合蛋白DT390‑Cap及其制备与应用；可溶性融合蛋白DT390‑Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示；可溶性融合蛋白DT390‑Cap，其碱基序列如SEQ ID NO:1所示；本发明通过试验证明：在使用或不使用ISA201佐剂的情况下，和单独免疫接种Cap相比，融合蛋白DT390‑Cap免疫接种小鼠后诱导产生的抗Cap特异性抗体显著升高，且能有效抑制PCV2在小鼠肺、肝和胸腺中的增值。采用融合表达的方式，DT390能增强Cap的免疫原性和免疫效果，并为后继其他基因工程亚单位疫苗的研发提供一种新的设计模式。

技术领域

本发明属于生物技术制药工业中基因工程领域，具体是一种可溶性融合蛋白DT390-Cap及其制备与应用。

背景技术

猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus-associated diseases，PCVAD）目前仍是对养猪业造成严重危害的疾病之一。猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV2）是PCVAD的主要病原体。PCV2基因组包含两个主要的开放阅读框（Open readingframe，ORF），其中ORF2编码的衣壳蛋白（Cap）是主要结构蛋白，具有良好的免疫原性，能刺激动物机体产生针对PCV2的特异性免疫应答，是研发新型亚单位疫苗的主要靶蛋白。基于Cap研发的PCV2亚单位疫苗包括细菌载体疫苗，杆状病毒载体疫苗，酵母载体疫苗，活载体表达疫苗和DNA疫苗。相关的研究表明，PCV2亚单位疫苗对来自不同地区、不同基因型的PCV2感染具有良好的免疫保护力，既能诱导免疫仔猪产生针对PCV2的特异性体液免疫应答，又能诱导产生细胞免疫应答，能显著减轻病毒血症，减少鼻腔和排泄物中PCV2 的排出量，降低各组织器官中PCV2的病毒载量。然而，免疫原性低仍然是Cap亚单位疫苗的主要问题。

白喉毒素（Diphtheria toxin，DT）是由感染β噬菌体的白喉棒状杆菌（Corynebacterium diphtheriae）所产生的外毒素，分子大小为58.4 kDa，主要由三个彼此独立的结构域组成，从N端到C端依次为催化区（C区），跨膜转运区（T区）和细胞膜受体结合区（R区）。CRM197（Cross-reacting materials 197）是白喉毒素的一种无毒突变体，具有良好的安全性，其作为抗原的载体蛋白在疫苗的研发中得到了广泛应用。白喉毒素截短片段DT390是白喉毒素N端1-390个氨基酸，包括催化区和跨膜转运区。根据前期的研究发现，DT390与其他蛋白融合表达时，能够增强其他蛋白的免疫原性。

发明内容

本发明利用DT390和Cap的优点，提供了一种融合蛋白DT390-Cap的制备与应用；将DT390和Cap基因进行优化后串联，利用巴斯德毕赤酵母表达系统表达了DT390-Cap融合蛋白，通过免疫接种试验和攻毒保护试验评价了DT390-Cap的免疫原性和免疫效果。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：一种可溶性融合蛋白DT390-Cap，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所述可溶性融合蛋白DT390-Cap，在制备猪圆环病毒2型疫苗中的应用。

所述 DT390蛋白在制备基因工程亚单位疫苗中的应用。

本发明进一步提供了一种可溶性融合蛋白DT390-Cap的制备方法，包括以下步骤：

pwPICZalpha-DT390-Cap表达载体的构建：以pwPICZalpha-Cap作为模板，使用带有XhoI和NcoI位点的上游引物和带有EcoRI位点的下游引物进行PCR扩增；扩增产物进行XhoI和EcoRI双酶切后克隆到pwPICZalpha用于测序；经测序正确的扩增产物经NcoI和EcoRI双酶切后，克隆到含有DT390的pwPICZalpha-DT390中，构建得到pwPICZalpha-DT390-Cap；