[发明专利]一种间充质干细胞分泌因子与内容物和绞股蓝干细胞提取物组合物及其制备方法

权利要求书

1.一种间充质干细胞分泌因子与内容物和绞股蓝干细胞提取物组合物，其特征在于：包括以下重量组分的原材料，间充质干细胞分泌因子冻干粉、绞股蓝干细胞提取物、透明质酸、蚯蚓激酶、芳香剂、乳化剂、增稠剂；

其中，间充质干细胞分泌因子冻干粉10-25份、绞股蓝干细胞提取物10-20份、透明质酸10-30份、蚯蚓激酶1-8份、芳香剂0.01-1份、乳化剂2-10份、增稠剂0.1-1份。

2.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子与内容物和绞股蓝干细胞提取物组合物，其特征在于：所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉10-15份、绞股蓝干细胞提取物10-15份、透明质酸15-25份、蚯蚓激酶2-5份、芳香剂0.01-0.05份、乳化剂3-5份、增稠剂0.1-0.5份。

3.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子与内容物和绞股蓝干细胞提取物组合物，其特征在于：所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，绞股蓝干细胞提取物10份，透明质酸15份，蚯蚓激酶2份，芳香剂0.03份，乳化剂3份、增稠剂0.5份。

4.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子与内容物和绞股蓝干细胞提取物组合物，其特征在于：所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉15份，绞股蓝干细胞提取物15份，透明质酸25份，蚯蚓激酶5份，芳香剂0.05份，乳化剂5份、增稠剂0.5份。

5.根据权利要求1所述的一种间充质干细胞分泌因子与内容物和绞股蓝干细胞提取物组合物，其特征在于：所述原材料包括以下材料及重量组分：间充质干细胞分泌因子冻干粉10份，绞股蓝干细胞提取物15份，透明质酸20份，蚯蚓激酶4份，芳香剂0.05份，乳化剂5份。

6.根据权利要求1-5所述的一种间充质干细胞分泌因子与内容物和绞股蓝干细胞提取物组合物，其特征在于：所述间充质干细胞分泌因子与内容物的制备如下：

第一步：间充质干细胞的组织成分液获取步骤：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的PBS缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，然后将收集的间充质干细胞放置与加入不含丙酮，不含酚红，不含二甲基亚砜制剂的细胞培养基细胞培养基(无菌蒸馏水1000ml，60％低糖DMEM，40％MCDB201为基础培养源，然后添加(按体积计算)1％～3％胎牛血清、维生素B1(单独灭菌)1μg/ml，维生素B6(单独灭菌)2mg/ml，5～15μg/L碱性成纤维细胞生长因子、10～25μg/L血小板生长因子、5～15μg/L内皮细胞生长因子，5～15μg/L表皮细胞生长因子，0.25～0.5g/L胎盘白蛋白，NaCl(氯化钠)0.5g，完全培养基和含双抗的PBS缓冲液体积比为1∶3～5，总PH值缓冲至7.2土0.2可由碳酸氢钠或磷酸二氢钠调节)中的新容器内，此时采用酶溶细胞破壁法，在细胞培养基中加入溶壁酶，所需浓度为1-2％(W/V)，酶解温度为25-35℃，酶解时间为1-2小时，用倒置显微镜观察细胞破碎程度，满意后所制得液体为间充质干细胞的组织成分液；

第二步，向细胞培养工厂中继续加入蛋白培养基P1和含双抗的PBS缓冲液继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入PCFT聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用无菌蒸馏水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞的组织成分的蛋白加强培养液；

第三步，纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质的溶液；

以上三步获得的均为间充质干细胞的组织成分；

第四步，间充质干细胞的干细胞分泌因子液获取步骤：取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的PBS缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的A液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基P1(P1：无菌蒸馏水1000ml，甘氨酸0.5g，天冬酰胺0.5g，天冬酰胺0.5g，丝氨酸0.5g，苏氨酸0.5g，半胱氨酸0.5g，Na2HPO4(磷酸氢二钠)2.0g，KH2PO4(磷酸二氢钾)3.0g，NaCl(氯化钠)0.5g，NH4Cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素B1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的PBS缓冲液，继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入PCFT聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体为间充质干细胞分泌素；

第五步，取设定的间充质干细胞加入到细胞培养工厂中进行培养，获得目标数量的间充质干细胞，然后用含有双抗的PBS缓冲液反复对细胞培养工厂中的目标间充质干细胞进行清洗，移出含间充质干细胞的A液前体后，继续向原有细胞培养工厂中再次添加蛋白培养基P2(P2：无菌蒸馏水1000ml，胰蛋白胨5.0g,Na2HPO4(磷酸氢二钠)2.0g，KH2PO4(磷酸二氢钾)3.0g，NaCl(氯化钠)0.5g，NH4Cl(氯化铵)0.5g,葡萄糖(单独灭菌)10.0g，维生素B1(单独灭菌)1μg/ml.)和含双抗的PBS缓冲液，继续进行培养，通过蛋白反应测试，达到目标蛋白浓度后，吸取细胞培养工厂中的上清液，放置与新的容器内，在上清液中加入PCFT聚合铁阳离子高分子聚合絮凝剂，使所吸取的上清液中蛋白质发生沉淀，然后将含有沉淀的上清液通过纤维滤纸或滤膜进行过滤，将过滤沉淀的蛋白质转移到半透膜中，用去离子水对半透膜中的沉淀物质进行数次清洗，将以蛋白质为主要成分的沉淀从半透膜上收集至新容器中，所制得液体也是间充质干细胞分泌素；

第六步，纤维滤纸或滤膜进行过滤后不沉淀的溶解液，收集至新容器内，经再次灭菌处理，获得物为细胞内可溶性的大量粘多糖，脂肪小体等小分子物质，所制得液体也是间充质干细胞分泌素。