[发明专利]基于二代和三代测序技术的植物线粒体基因组组装方法

说明书

本发明公开了一种基于二代和三代测序技术的植物线粒体基因组组装方法，对样品DNA进行二代测序和三代测序，利用二代测序数据进行三代数据的校正；利用构建好的植物线粒体编码基因数据库，使用此植物线粒体编码基因数据库中所有参考序列比对第（3）步校正得到的三代序列数据集，获取seed序列进行下一步分析；对seed序列进行延伸，获取全长的线性线粒体基因组DNA序列，对线性线粒体基因组DNA序列进行环化，获取环状线粒体基因组DNA序列。本发明组装方法能够快速地从三代测序数据中得到完整的植物线粒体基因组序列，适用于大部分植物线粒体基因组。

技术领域

本发明涉及一种基于二代和三代测序技术的植物线粒体基因组组装方法。

背景技术

随着二代和三代测序技术的发展，通量提高和测序成本的快速下降，极大的推动了线粒体基因组学的发展。

植物线粒体（mitochondrion）是一种存在于大多数植物细胞中的由两层膜包被的细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，被称为power house。

植物线粒体基因组结构和大小是高度变化的，通常植物线粒体基因组是一个单链环状DNA分子结构，如拟南芥、西瓜；也有植物线粒体基因组以线性DNA分子存在，如水稻等；此外线粒体基因组中存在多元环状的情况，例如蝇子草中存在59个环状DNA序列，包括1个主环和58个小环。高等植物在所有已知的高等生物中拥有最大的线粒体，从200kb到11M变化不等。同一物种线粒体基因组大小差异主要是由重复序列尤其是基因区的非编码序列引起的。线粒体基因组的进化方式主要靠内部重组和外部重组，内部重组即是由于复杂而引起的内部重排，是序列获得和缺失的主要原因；外部重组是指核、叶绿体、类质体以及未知来源的序列整合到植物线粒体基因组导致的重组。

传统的获取线粒体基因组的方法是通过Long-range PCR对植物线粒体基因组进行扩增和Sanger测序，最后对测序得到的不同片段进行拼接得到完整的植物线粒体基因组。但该方法成本高，效率低。

而现有的通过高通量测序方法进行植物线粒体基因组组装的软件和方法，只能解决一部分的高等生物线粒体组装问题，比如使用目前已开发的线粒体组装工具，只能获取高等植物线粒体基因组线性序列，不能成环，而且得到的序列普遍存在不完整的现象。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于二代和三代测序技术的植物线粒体基因组组装方法，拼接完整度高，可以获取完整的环状植物线粒体基因组序列。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种基于二代和三代测序技术的植物线粒体基因组组装方法，其步骤包括：

（1）对样品DNA进行二代测序，得到Clean reads；

（2）对样品DNA进行三代测序，得到Clean reads；

（3）利用二代测序数据进行三代数据的校正；

（4）利用构建好的植物线粒体编码基因数据库，使用此植物线粒体编码基因数据库中所有参考序列比对第（3）步校正得到的三代序列数据集，使用的比对软件是blast（v2.10.1+），evalue阈值设置为10^-10、相似度和覆盖度均大于70%，记录比对上的编码基因名称信息，挑选比对上的最长的一条序列作为seed序列，获取得到的seed序列进行下一步分析；其中植物线粒体基因数据库是从美国国家生物技术信息中心（NCBI）中下载目前已发表的所有植物线粒体基因组基因，用来构建参考序列数据库，数据库需要定期更新，通常每个月更新一次；