[发明专利]一种青蒿内生菌的分离纯化方法及其应用

说明书

一种青蒿内生菌的分离纯化方法，包括以下步骤：1)采集青蒿的完整植株，清洗，分别取根、茎、叶；2)分别对根、茎、叶进行表面消毒处理；3)取叶，用无菌水进行研磨，静置，取上清液，取茎，切为小段，取根，切为小段，分别将上清液、茎段、根段的切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；4)将步骤3)得到的牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1～2d，得到的高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d；5)待各平板上菌落长出，判断菌落的种类，经多次分离、纯化，分别得到纯化的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落。本发明分离过程简单、高效，可有效分离得到青蒿内生菌，且进行初步分类。

技术领域

本发明涉及医药领域，特别涉及一种青蒿内生菌的分离纯化方法及其应用。

背景技术

植物内生菌是一类重要的微生物资源，从20世纪90年代起逐渐成为微生物学家们关注的热点。近年来，越来越多的研究证明内生菌可产生与宿主植物相同或相似的次级代谢产物，因此从植物内生菌中获得各种新资源的可能性是十分巨大的。从药用植物中分离、筛选能够产生与宿主植物相同或相似生物活性物质的内生菌已成为筛选微生物药物的重要来源，特别是以抗菌、抗肿瘤等指标为主的药物开发，是植物内生微生物研究中最耀眼的亮点。

青蒿是菊科植物黄花蒿的全草，具有抗疟、抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫、免疫调节等作用。药用植物青蒿化学成分中的挥发油和青蒿素都具有抗菌作用。青蒿内生菌长期与青蒿共存，可能产生青蒿挥发油或青蒿素，从而使内生菌具有抑菌作用。

国内外关于内生菌的研究报道很多，但关于青蒿内生菌抑菌作用的资料较少。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种青蒿内生菌的分离纯化方法，其分离过程简单、高效，可有效分离得到青蒿内生菌，且进行初步分类。

本发明的技术方案是：一种青蒿内生菌的分离纯化方法，包括以下步骤：

1)采集青蒿的完整植株，清洗，分别取下完整植株的根、茎、叶；

2)分别对步骤1)得到的根、茎、叶进行表面消毒处理；

3)取叶，用无菌水进行研磨，静置，取上清液，涂布在牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上，取茎，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；取根，切为小段，切面向下置于牛肉膏蛋白胨平板、高氏一号平板、PDA平板上；

4)将步骤3)得到的牛肉膏蛋白胨平板倒置于36±1℃环境下培养1-2d，得到的高氏一号平板、PDA平板倒置于28℃环境下培养7d；

5)待各平板上菌落长出，判断菌落的种类，经多次分离、纯化，分别得到纯化的细菌典型菌落、放线菌典型菌落、真菌典型菌落。

进一步的，步骤1)所述青蒿的完整植株，为9月份采集的健康、无病虫害的野生青蒿，所述清洗，为用流水冲洗。

进一步的，步骤2)所述表面消毒的方法为，分别将根、茎、叶用流水冲洗5h，用滤纸将根、茎、叶表面的水分吸干，经紫外线照射20min后，用75％酒精浸泡2min，然后用无菌水冲洗三次，再用5.4％的NaClO溶液浸泡，其中，根和茎的浸泡时间为10min，叶的浸泡时间为5min，最后用无菌水漂洗三次。

进一步的，步骤2)消毒处理后，采用漂洗液检查法和组织印迹检查法进行可靠性检验。