[发明专利]一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用

说明书

本发明公开了一种重组SIRPα‑TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用。基于从干预或阻断SIRPα‑CD47相互作用方面入手，针对癌细胞膜和巨噬细胞膜上已知位点及可启动下游凋亡信号通路的经典理论，将TRAIL(肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体)和SIRPα两个功能区的氨基酸序列进行重组，构建SIRPα‑TRAIL融合蛋白，目标是阻断SIRPα与CD47的结合，促进巨噬细胞吞噬，同时利用TRAIL竞争癌细胞膜上特异性死亡受体DR4/DR5结合，不仅干预了CD47与SIRPα的结合，又能激活下游凋亡信号级联反应，促进癌细胞凋亡。重组SIRPα‑TRAIL融合蛋白的设计开辟一种新的抗肿瘤治疗策略，是一种促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞和促肿瘤细胞凋亡的双重抗癌作用的融合蛋白。

技术领域

本发明涉及一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

癌症的治疗观已经从细胞攻击模式开始向靶向性治疗模式转变。因此，现阶段肿瘤治疗研究的热点就聚焦于治疗靶点的选择和靶向药物的研发。目前，虽然单一治疗方法是一种常见的策略，但癌症的发生是多方面、多因素、多基因靶点调控的复杂事件，临床试验中已经广泛探索了联合治疗方法，它们被认为是治疗癌症的关键。相对于只能阻断一种信号通路的单一靶点抑制剂，联合靶点治疗似乎更有效。所以，单一靶点常见的癌细胞通过其他通路逃逸、发生恶性发展，复发、转移以及耐药现象等问题，在多靶点中得以控制，多靶点治疗将成为攻克癌症新途径。

融合蛋白(Fusion protein，FP)是在人工条件下，有目的的将两段或多段编码功能蛋白的基因连接在一起表达出所需要的蛋白，这种通过基因重组技术将两个或多个基因的编码区首尾连接，由同一调控序列控制构成的基因表达后所得的蛋白质产物称为融合蛋白。FP技术是为获得大量标准FP而进行的有目的性的基因融合和蛋白表达方法，可构建和表达具有多种功能的新型目的蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。

为实现上述目的本发明采用以下技术方案：

一种重组SIRPα-TRAIL融合蛋白的构建方法，包括如下步骤：

步骤1.SIRPα-TRAIL融合蛋白序列设计，查找TRAIL和SIRPα功能序；

步骤2.将获得的基因片段融合；

步骤3.构建带有His标签的pET28(+)-SIRPα-TRAIL的表达质粒；

步骤4.SIRPα-TRAIL融合蛋白带有his原核表达系统建立；

步骤5.SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)扩大培养的生长曲线；

步骤6.鉴定SIRPα-TRAIL融合蛋白in BL21(DE3)诱导成功；

步骤7.SIRPα-TRAIL融合蛋白表达位置鉴定；

步骤8.SIRPα-TRAIL融合蛋白包涵体的洗涤及溶解；

步骤9.SIRPα-TRAIL融合蛋白的纯化；

步骤10.融合蛋白的复性除盐；

步骤11.冷冻干燥，得到SIRPα-TRAIL融合蛋白粉末。

作为本发明进一步的方案，步骤4中SIRPα-TRAIL融合蛋白带有his原核表达系统建立，具体内容如下：

将提取的pET28(+)-SIRPα-TRAIL质粒转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，转化后的大肠杆菌划线涂抹于固体培养基上，37℃过夜培养后，观察转化结果提示转化成功。