[发明专利]半月板细胞-滑膜细胞双特异性适配体及其应用

说明书

本发明提供了一种靶向结合半月板细胞和滑膜细胞的适配体，所述适配体为单链DNA分子，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明的双特异性适配体还保留了骨性关节炎滑膜细胞适配体和半月板细胞适配体的二级结构，因此，所述双特异性适配体能够特异性结合骨性关节炎滑膜细胞适配体和半月板细胞，可特异性的识别这两种细胞。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种能同时特异性地靶向结合半月板细胞和滑膜细胞的单链DNA适配体及其应用。

背景技术

半月板是位于膝关节股骨髁和胫骨平台之间的纤维软骨垫，可伴随膝关节的运动适度延展和位移，并能传导负荷，稳定胫骨关节，吸收冲击和震荡，减少股骨和胫骨间的磨损，对膝关节的正常生理功能至关重要。半月板损伤是膝关节最常见的损伤之一，多见于青壮年，可在外力作用下或半月板自身疾病的基础上发生，引起膝关节肿胀、疼痛、活动功能障碍，而直接切除损伤的半月板可使关节面软骨应力集中而发生退变，导致骨关节炎，对生活有极大影响，因此为了避免半月板缺损后继发的骨关节炎，修复半月板，恢复半月板的生物学性能十分重要。

目前半月板损伤主要的治疗方法是关节镜下半月板修复，手术通过不可吸收缝线对半月板缝合修补，保留了半月板完整性，但其修补后的生物力学性质和功能较原生半月板仍有差异，且有手术后半月板生长不佳需要切除的风险。半月板移植术应用于重建缺失的半月板，主要以同种异体半月板移植为主，但部分患者接受移植后发生对异基因细胞的移植排斥反应，移植物长期存活率很低。目前重建缺损半月板的治疗中组织工程技术更有希望，它利用种子细胞在体外增殖并与支架材料结合，在各种细胞因子的作用下刺激细胞外基质(extracellular Matrix,ECM)的分泌，用于替代损伤的半月板。组织工程细胞来源大致可分为干细胞和成熟细胞两类，间充质干细胞因其组织来源广泛，可塑性强而得到更多的研究与应用，但间充质干细胞移体外培养后可能出现增殖能力下降、基因突变和肥大增生的问题，而自体成熟细胞体外培养单层扩增后细胞增殖分化能力下降，最适合用于重建半月板的组织工程细胞来源仍在寻找中。半月板的生物结构由半月板细胞及Ⅰ、Ⅱ型胶原及糖胺多糖组成，而实验证实半月板重建后的生物力学强度与胶原的沉积量正相关，因此增加半月板损伤部位的半月板细胞数量及促进ECM的合成对于半月板白区的修复十分重要。同时大量实验显示滑膜细胞在半月板修复中同样扮演重要角色，因其能分泌大量以Ⅰ型胶原为主的ECM并能在半月板撕裂部位生长滑膜组织。更有实验证实修复半月板的内源性细胞中，半月板滑膜交界处的滑膜细胞的作用更为关键。因此目前急需一种具有在半月板撕裂的局部能募集自体来源半月板及滑膜细胞并促进ECM合成的治疗方法使损伤的半月板得到解剖及生物结构的修复，来改善半月板撕裂修复后的生物学性能。

适配体是一类可以介导细胞识别，实现细胞募集的核酸。核酸适配体是通过指数富集系统配体进化技术(SELEX)从特定的核苷酸库筛选获得的，与靶标具有高亲和力和特异性结合的单链DNA或RNA核酸序列片段。通过该技术获得的核酸适配体能够折叠形成特定且稳定的三级结构，能以高亲和力和特异性结合靶分子。适配体与传统亲和力工具相比具有独特的优势，包括低分子量、高渗透性、强特异性、可对位点特异性修饰、可重复使用、可长期保存、无免疫原性等。CELL-SELEX技术是使用活细胞筛选适配体的技术，其获得的适配体可对活细胞靶向识别，目前已在肿瘤诊断治疗上得到应用，在CELL-SELEX技术的基础上，最近演化出双特异性适配体交联技术，可将两个特异性不同的适配体构成二价适配体而构建出一类具有双特异识别能力的二价适配体，可同时与两种不同的细胞靶向结合。介于这种交联技术，我们获得一种能同时与滑膜细胞和半月板细胞靶向结合的双特异性适配体。

发明内容

在本发明中我们将筛选的滑膜细胞适配体和半月板细胞适配体交联得到滑膜半月板双特异性适配体并验证了其细胞募集能力，在半月板修复技术中可实现半月板细胞和滑膜细胞的募集并黏附于半月板，达到募集体内细胞修复半月板的目的。

本发明通过以下技术方案实现本发明的目的：