[发明专利]于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系、方法及应用

权利要求书

1.一种于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系，其特征在于，包含基础培养基以及添加在该基础培养基内的0.01-500μM TGFβ抑制剂、0.01-500μM BMP抑制剂、0.01-50μM GSK3抑制剂、0.01-500ng/mL FGF家族生长因子、0.01-500ng/mL EGF家族生长因子。

2.根据权利要求1所述的于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系，其特征在于：

其中，所述基础培养基包括DMEM/F12液体基础培养基、0-5×B27添加剂、0-5×N2添加剂、1％青霉素/链霉素、0.01-500μg/mL 2-磷酸-维生素C；

所述GSK3抑制剂包括CHIR99021、BIO及LY2090314中的一种或多种；

TGFβ抑制剂包括SB431542、LY2109761及A-83-01中的一种或多种；

BMP抑制剂包括DMH1、K02288、LDN-193189、Noggin中的一种或多种；

EGF家族生长因子包括EGF、TGFα及HB-EGF中的一种或多种；

FGF家族生长因子包含FGF 1～FGF23中的任意一种或多种。

3.根据权利要求2所述的于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系，其特征在于：

其中，B27添加剂的量为0.5×B27添加剂，N2添加剂的量为0.5×N2添加剂，2-磷酸-维生素C的浓度为60μg/mL。

4.根据权利要求2所述的于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系，其特征在于：

其中，TGFβ抑制剂为2μM的SB431542，BMP抑制剂为2μM的DMH1，GSK3抑制剂为3μM的CHIR99021，EGF家族生长因子为10ng/mL的EGF，FGF家族生长因子为10ng/mL的FGF2。

5.根据权利要求1所述的于体外将人多能干细胞诱导为神经中胚层祖细胞并维持自我更新的培养体系，其特征在于：

其中，人多能干细胞为人胚胎内细胞团来源的胚胎干细胞细胞系或经体细胞重编程获得的诱导性多能干细胞。

6.采用权利要求1～5任一项所述的培养体系诱导产生神经中胚层祖细胞并维持其自我更新的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、采用人多能干细胞培养基将人多能干细胞培养至细胞密度为50％-70％；

B、当人多能干细胞密度达到50％-70％时，使用所述培养体系进行细胞诱导，每天半量换液，在细胞密度达到90％时按1:6进行细胞传代，传代培养时向所述培养体系内添加非肌肉肌球蛋白IIATPase抑制剂，连续诱导10天以上。

7.根据权利要求6所述的诱导产生神经中胚层祖细胞并维持其自我更新的方法，其特征在于：

其中，步骤A中，所述人多能干细胞培养基的成分如下：基础培养基DMEM/F12、0.5×N2、0.5×B27、60μg/mL 2-磷酸-维生素C、1％青霉素/链霉素、40ng/mL碱性成纤维生长因子、2ng/mL转化生长因子-β。

8.根据权利要求6所述的诱导产生神经中胚层祖细胞并维持其自我更新的方法，其特征在于：

其中，步骤B中，非肌肉肌球蛋白IIATPase抑制剂为5μM的Blebbistatin。

9.根据权利要求6所述的方法获得的神经中胚层祖细胞在神经中胚层祖细胞产生及自我更新机制研究、脊髓损伤疾病体外药物筛选、脊髓损伤疾病治疗细胞、脊髓损伤修复组织工程中的应用。