[发明专利]用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法

说明书

本发明公开了治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，首先在无菌条件下将腹部皮下正常脂肪组织清除结缔组织、小血管、脂肪滴、脂肪粒，得到脂肪小块；进而将脂肪小块在完全培养液中培养，经过胰蛋白酶消化、离心处理后得到脂肪源干细胞，最后将脂肪源干细胞于完全培养液和抗凋亡保护剂中进行传代培养，其中抗凋亡保护剂不仅具有促进动物造血干细胞增殖、分化的功能，而且还在脂肪源干细胞培养过程中发挥抗凋亡保护作用，提高脂肪源干细胞的成活率以及后期诱导分化成功率，本发明采用组织块培养法操作简单，体外扩增能力强，增殖时间短，具有多向分化的潜能，通过诱导分化培育能够成为软骨细胞，有助于治疗退行性关节炎。

技术领域

本发明属于干细胞制备技术领域，具体地，涉及用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法。

背景技术

退行性关节炎又称骨关节炎、老年性关节炎、肥大性关节炎，主要症状为关节疼痛，常为休息痛，表现为休息后出现疼痛，活动片刻即缓解，但活动过多后，疼痛又加剧，另一症状是关节僵硬，常出现在早晨起床时或白天关节长时间保持一定体位后，检查受累关节可见关节肿胀、压痛，活动时有摩擦感或“咔嗒”声，病情严重者可能有肌肉萎缩及关节畸形。

脂肪源干细胞是一类可以自我更新、繁殖的干细胞，具有一般干细胞的多向分化潜能和稳定的体外多代谢增值能力，不仅能够在不同诱导因子的作用下分化成为脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、肌肉细胞、神经细胞，而且还能分泌作用于成纤维细胞，促进分泌Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白，促进胶原合成，可发挥抗炎、抗氧化、抗衰老、损伤修复等作用。

利用脂肪源干细胞进行体外培养能够改善治疗退行性关节炎，但是其提取困难，因此，提供一种快速高效的脂肪源干细胞的提取方法是目前需要解决的技术问题。

发明内容

本发明的目的在于提供用于治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法。

本发明需要解决的技术问题为：

现有技术中，脂肪源干细胞提取多用胰酶消化，提取干细胞过程繁琐，纯度不高，影响干细胞后期的增殖分化甚至其诱导形成过程，因此提供一种干细胞纯度高、提供方法简单、细胞活性高的提取方法是目前需要解决的技术问题。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

治疗退行性关节炎的自体脂肪源干细胞的提取方法，包括以下步骤：

第一步、在无菌条件下，取腹部皮下正常脂肪组织，清除明显的结缔组织及肉眼可见的小血管，用PBS缓冲液清洗3-5遍脂肪组织，再将其置于PBS缓冲液中用灭菌眼科剪将脂肪组织进行剪碎处理，再用眼科剪小心剔除痉膜、脂肪滴和脂肪粒，得到脂肪小块；

第二步、向无菌培养皿中加入1-3mL血清并将其摇晃铺匀，将25-35块第一步得到的脂肪小块放入无菌培养皿中，保持脂肪小块之间的间隔4-6mm，然后向无菌培养皿中加入3-4mL的完全培养液，静置培养3-5min后，然后缓慢倒置培养皿，将倒置后的培养皿置于体积分数3-5％的CO₂培养箱中，100％湿度、37℃下温育4h后，再次翻转培养皿，加入2-4mL完全培养液，之后每2-3天更换一次培养液，培养一周以后刮除脂肪小块；

第三步、当脂肪源性干细胞生长至铺满培养皿底部80-90％时，将培养皿转移至超净台上，用酒精棉球将超净台擦拭二遍，倒出培养皿中的培养液，用PBS缓冲液清洗培养皿底部1-2次，将清洗后的废液倒出，向培养皿中加入1-2mL的浓度2.5g/L胰蛋白酶消化液，于37℃下消化1-3min后，倒置于相差显微镜下观察到细胞回缩、变圆、间隙增大时，立即加入完全培养液终止消化；