[发明专利]植物蛋白多肽在玻璃化冷冻液中的应用、玻璃化冷冻液组合物及制备方法

说明书

本发明属于辅助生育的技术领域，涉及植物蛋白多肽在玻璃化冷冻液中的应用，所述植物蛋白多肽用于制备玻璃化冷冻液，为冷冻液提供合适的粘度、渗透压以及接近血清的环境，所述植物蛋白多肽的分子量为60000～80000道尔顿；上述植物蛋白多肽的制备方法是：以植物蛋白为原料，在中性磷酸缓冲液中，使用蛋白酶在37℃下水解，使植物蛋白酶解成分子量为60000～80000道尔顿的植物蛋白多肽，之后升温至90℃～100℃灭酶，降至室温，用微滤膜透析，收集透析液；本发明还提供了玻璃化冷冻液组合物及其制备方法。本发明提供了一种人血清蛋白的替代方案，使用植物蛋白多肽制备玻璃化冷冻液，具有成本更低，安全性更高的优点。

技术领域

本发明属于辅助生育的技术领域，涉及一种植物蛋白多肽在玻璃化冷冻液中的应用、玻璃化冷冻液组合物及制备方法。

背景技术

生殖细胞和胚胎的冷冻技术是人类辅助生殖技术的重要组成部分。由于生殖细胞和胚胎中含水量大，在冷冻过程中容易出现冰晶，导致细胞出现机械损伤。目前使用的冷冻技术主要有程序化冷冻和玻璃化冷冻。程序性冷冻采用了较低浓度的渗透性防冻保护剂，通过精确的程序化缓慢降温，防止出现较大的冰晶，提高解冻后的存活率。玻璃化冷冻采用了高浓度的防冻剂，快速降温形成无定型的玻璃样物质，冷冻和解冻过程中不出现冰晶，防止了细胞在冷冻和解冻过程中的机械损伤。玻璃化冷冻技术以其操作简便快速、成活率高等优点已经成为生殖冷冻技术的新方向。

目前使用的玻璃化冷冻液一般由基础液、渗透性保护、非渗透性保护剂、人血清蛋白等成分组成。其中人血清蛋白可以为冷冻液提供合适的粘度、渗透压以及接近血清的环境，作用比较关键。

例如，中国发明专利申请CN111280166A公开了一种囊胚的玻璃化冷冻液及冷冻方法，包括平衡液、冷冻液1和冷冻液2；所述平衡液包括基础平衡液和蛋白添加物；所述蛋白添加物在平衡液中的浓度为1～11mg/ml；所述冷冻液1包括聚乙烯砒咯烷酮、乙二醇、二甲亚砜和所述平衡液，所述冷冻液1中聚乙烯砒咯烷酮的浓度为1～100mg/ml；所述冷冻液2包括聚乙烯砒咯烷酮、乙二醇、二甲亚砜、海藻糖、聚蔗糖和所述平衡液，所述冷冻液2中海藻糖的浓度为0.1～1.2mol/L，聚蔗糖的浓度为2～35mg/ml，聚乙烯砒咯烷酮的浓度为1～100mg/ml。

又如，中国发明专利申请CN108244102A、CN109644984A及CN108244100A均公开了类似的玻璃化冷冻液，上述专利虽然在其他成分上做了改进，但都无一例外的使用了人血清蛋白。人血清蛋白成本较高，且存在携带病毒和交叉感染的风险。因此，开发一种易得、廉价、安全的成分替代人血清蛋白很有必要。

发明内容

本发明针对现有技术的不同，提供了一种人血清蛋白的替代方案，使用植物蛋白多肽制备玻璃化冷冻液，具有成本更低，安全性更高的优点。

本发明提供了植物蛋白多肽在玻璃化冷冻液中的应用：所述植物蛋白多肽用于制备玻璃化冷冻液，为冷冻液提供合适的粘度、渗透压以及接近血清的环境，所述植物蛋白多肽的分子量为60000～80000道尔顿。

上述植物蛋白多肽的分子量与人血清蛋白66000～69000道尔顿的分子量相当，从理论上可以替代人血清蛋白用于玻璃化冷冻液中。

上述分子量的植物蛋白多肽通过以下方法制备：以植物蛋白为原料，在中性磷酸缓冲液中，使用蛋白酶在37℃下水解，使植物蛋白酶解成分子量为60000～80000道尔顿的植物蛋白多肽，之后升温至90℃～100℃灭酶，灭酶时间为10分钟，之后降至室温，用微滤膜透析，收集透析液。

本发明可以通过控制蛋白酶的加入量和酶解时间来控制植物蛋白多肽的分子量。例如，上述植物蛋白与磷酸缓冲液的质量比为1：10左右，上述蛋白酶的加入量约为：每1g植物蛋白加入1万单位的蛋白酶。通过6小时左右的酶解，检测多肽的分子量，植物蛋白多肽的分子量区间正好处于60000～80000道尔顿。当然，也可以使用其他酶解条件，只需酶解后植物蛋白多肽的分子量控制在60000～80000道尔顿即可。