[发明专利]一种用于检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂及方法

说明书

本发明提供一种检测鼠疫耶尔森菌的荧光PCR试剂及方法。本发明提供的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂以鼠疫耶尔森菌染色体上的dam基因和pPCP1质粒上的pla基因作为检测靶标，对大部分菌株有较高的检测灵敏度，又确保个别菌株不会因pla基因缺失而被漏检。该试剂所用的引物、探针序列是基于最新的鼠疫耶尔森菌核酸序列信息设计筛选所得，具有良好的包容性、特异性和反应性能，能保证检测的准确性。优选地，本发明运用冷冻干燥技术将鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂制成冻干型试剂，常温下稳定，无需冷链运输和保存，从而避免了常规液体荧光PCR检测试剂因保存温度变化或反复冻融而失效的风险，适应长途运输和冷链条件差的地区的使用需要，使用时直接加核酸样本即可上机检测。

技术领域

本发明涉及病原微生物检测技术，具体地说涉及鼠疫耶尔森菌的核酸检测。

背景技术

鼠疫是我国传染病防治法规定的甲类传染病，其病原体为鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)。鼠疫依发病部位不同可分为腺鼠疫、败血型鼠疫、肺鼠疫、肠鼠疫、脑膜炎型鼠疫、眼鼠疫、皮肤鼠疫等，其中以腺鼠疫最常见。鼠疫的主要传播途径有：(1)蚤类叮咬。鼠疫的最主要传染源是啮齿类动物，鼠疫耶尔森菌可通过蚤类叮咬传染给人类和其他动物。人类鼠疫的首发病例多由寄生于家鼠的印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)叮咬所致。鼠疫耶尔森菌经皮肤进入人体，沿淋巴循环和血循环扩散，引起腺体坏死和败血症，即腺鼠疫和败血型鼠疫。(2)接触传播。鼠疫耶尔森菌可以通过伤口，包括如手指的倒刺等细小的伤口等进入人体，然后经淋巴管或血液引起腺鼠疫或败血型鼠疫。(3)飞沫传播。鼠疫患者呼吸道中的鼠疫耶尔森菌可经呼吸、咳嗽飞沫进行传播，吸入一定数量的鼠疫耶尔森菌后，可引起肺鼠疫。(4)食物传播。鼠疫耶尔森菌可通过食物，主要是未煮熟的鼠疫病死动物，感染消化道，引发肠鼠疫。对鼠疫的实验室检验除了血常规、尿常规、便常规、影像学、免疫学等之外，还离不开对鼠疫耶尔森菌的核酸检测。

鼠疫耶尔森菌分类学属于变形菌门、γ-变形菌纲、肠杆菌目、肠杆菌科、耶尔森菌属、鼠疫耶尔森菌。鼠疫耶尔森菌也称“鼠疫杆菌”，呈革兰氏阴性、短小杆状。基因组由一条环状染色体(约4.65Mb)和3个质粒(pCD1、pPCP1、pMT1)组成，其中pPCP1和pMT1是鼠疫耶尔森菌特有的质粒。基于荧光PCR技术的核酸检测是鼠疫耶尔森菌检测的重要手段，需对患者淋巴结穿刺液、血液、痰液，咽部或眼分泌物、吐泻物、脑脊液、管状骨骨髓或其它脏器标本中检测鼠疫耶尔森菌。出于特异性和灵敏度的考虑，现有的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂多以pPCP1质粒上的编码plasminogen activator的pla基因和pMT1质粒上编码F1 capsuleantigen的caf1基因作为检测靶标。研究表明pPCP1质粒在鼠疫耶尔森菌细胞中有150-200个拷贝，但2％的鼠疫耶尔森菌不含pPCP1质粒；pMT1质粒在鼠疫耶尔森菌细胞中有两个拷贝，但也有2％的鼠疫耶尔森菌不含pMT1质粒。这意味着以pla基因和caf1基因为靶标检测鼠疫耶尔森菌存在一定的漏检风险。鼠疫的防疫和临床诊断需要一种更准确可靠，特别是能防止漏检风险的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂。

发明内容

本发明的目的是提供一种更准确可靠的鼠疫耶尔森菌PCR检测试剂。

本发明所要解决的技术问题通过以下技术方案来实现：

1.引物、探针设计及反应体系建立

本发明所述的鼠疫耶尔森菌荧光PCR检测试剂以鼠疫耶尔森菌染色体上编码DNAadenine methylase的dam基因和pPCP1质粒上的pla基因作为检测靶标。dam基因由于在染色体上，不容易丢失，在不同的菌株间具有良好的包容性；pla基因在质粒上，有丢失风险，但在大部分菌株中具有高达150-200个拷贝数。同时以dam基因和pla基因作为检测靶标既对大部分菌株有较高的检测灵敏度，又确保个别菌株不会由于pla基因缺失而漏检。本发明用于检测鼠疫耶尔森菌dam基因和pla基因引物探针分别基于GenBank数据库最新的鼠疫耶尔森菌核酸信息设计、筛选而得出，序列如下：